עדיטיד דורך Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, California, באוויליקט אויף 25 דעצעמבער 2020 (ריוויוד אויף 25 אקטאבער 2020)
מיר באַריכט די ינטעראַקשאַן צווישן סובוניץ אין די רעפּלאַקיישאַן פון קאָראָנאַווירוסעס-טראַנסקריפּשאַן קאַמפּלעקסאַז, וואָס זענען יקערדיק פֿאַר רעפּלאַקיישאַן און עוואָלוטיאָנאַרי קאַנסערוויישאַן.מיר האָבן צוגעשטעלט זאָגן אַז די NiRAN פעלד פֿאַרבונדן מיט nsp12 האט נוקלעאָסידע מאָנאָפאָספאַטע (נמפּ) טראַנספעראַסע טעטיקייט אין טראַנס, און יידענאַפייד nsp9 (אַן רנאַ ביינדינג פּראָטעין) ווי זייַן ציל.NiRAN קאַטאַליזירט די קאָוואַלענט אַטאַטשמאַנט פון די נמפּ טייל צו די קאַנסערווד nsp9 אַמינאָ טערמינוס אין אַ אָפּרוף וואָס רילייז אויף Mn2+ ייאַנז און שכייניש קאַנסערווד אַסן רעזאַדוז.עס איז געפונען אַז NiRAN טעטיקייט און nsp9 NMPylation זענען יקערדיק פֿאַר קאָראָנאַווירוס רעפּלאַקיישאַן.די דאַטן לאָזן אונדז צו פֿאַרבינדונג דעם טעטיקייט פון די נעסטעד ווירוס ענזיים מאַרקער צו די פריערדיקע אַבזערוויישאַנז אין די כייפּאַטאַסאַס אַז די ינישיישאַן פון רנאַ סינטעז אין אַ קלאַס פון רנאַ ווירוסעס איז פאַנגקשאַנאַלי און עוואָלוטיאָנאַרי קאָנסיסטענט.
די רנאַ-אָפענגיק רנאַ פּאָלימעראַסע (RdRps) פון Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae און 12 אנדערע משפחות) איז לינגקט צו די אַמינאָ-וואָקזאַל (N-וואָקזאַל) פעלד אין די ניט-סטראַקטשעראַל פּראָטעין (נספּ) באפרייט פון די פּאָליפּראָטעין, גערופֿן NiRAN 1אַב איז קאַמפּאָוזד פון וויראַל הויפּט פּראָטעאַסע (מפּראָ).ביז אַהער, די אַרטיריאַל ווירוס NiRAN-RdRp nsp ס אייגענע GMPylation / UMPylation טעטיקייט איז געווען רעפּאָרטעד, און עס איז געווען סאַגדזשעסטיד צו דזשענערייט אַ טראַנסיענט פֿאַר די אַריבערפירן פון נוקלעאָסידע מאָנאָפאָספאַטע (נמפּ) צו די (דערווייַל אומבאַקאַנט) ווירוס און / אָדער צעל ביאָפּאָלימעריזיישאַן טינגז.דאָ, מיר ווייַזן אַז די קאָראָנאַווירוס (מענטשלעך קאָראָנאַווירוס [HCoV]-229E און שטרענג אַקוטע רעספּעראַטאָרי סינדראָום קאָראָנאַווירוס 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) האט Mn2+-אָפענגיק נמפּילאַטיאָן אַקטיוויטעט, וואָס איז דערייווד פון nsp9 דורך די פאָרמירונג פון Mpro-mediated nsp9 נאָך די N-וואָקזאַל פלאַנגקינג נספּס איז פּראָטעאָליטיקלי באפרייט, די פאָספאָראַמידאַטע איז בונד צו די ערשטיק אַמינע (N3825) אין די N-וואָקזאַל פון נספּ9.וריידינע טריפאָספאַטע איז די בילכער נוקלעאָטידע אין דעם אָפּרוף, אָבער אַדענאָסינע טריפאָספאַטע, גואַנאָסינע טריפאָספאַטע און סיטידינע טריפאָספאַטע זענען אויך פּאַסיק קאָ-סאַבסטרייץ.מיוטיישאַן שטודיום ניצן רעקאָמבינאַנט קאָראָנאַווירוס nsp9 און nsp12 פּראָטעינס און דזשאַנעטיקלי ענדזשאַנירד HCoV-229E מיוטאַנץ באשלאסן די רעזאַדוז נייטיק פֿאַר NiRAN-מעדיאַטעד nsp9 נמפּילאַטיאָן און ווירוס רעפּלאַקיישאַן אין צעל קולטור.די דאַטן באשטעטיקט די פּראָגנאָז פון NiRAN אַקטיוו פּלאַץ רעזאַדוז און באשלאסן די וויכטיק ראָלע פון nsp9 N3826 רעזאַדוז אין nsp9 נמפּילאַטיאָן און ווירוס רעפּלאַקיישאַן אין וויטראָ.דער רעזאַדו איז טייל פון די קאַנסערווד N-וואָקזאַל NNE טריפּעפּטייד סיקוואַנס און פּרוווד צו זיין דער בלויז ינווייראַנמענאַל רעזאַדו פון nsp9 און זייַן כאָומאַלאַדזשיז אין די קאָראָנאַווירוס משפּחה.דער לערנען גיט אַ האַרט יסוד פֿאַר די פאַנגקשאַנאַל לערנען פון NMPylation טעטיקייט פון אנדערע נעסטעד ווירוסעס און לייגט מעגלעך טאַרגאַץ פֿאַר דער אַנטוויקלונג פון אַנטיוויראַל דרוגס.
Nidovirales positive-סטראַנדיד רנאַ ווירוס ינפעקץ אַ פאַרשיידנקייַט פון ווערטעבראַטעס און ינווערטאַברייץ (1, 2).דער סדר ינקלודז דערווייַל 14 פאַמיליעס (3), פון וואָס די קאָראָנאַווירוס משפּחה איז וויידלי געלערנט אין די לעצטע 20 יאָר.אין דער צייט, דריי זאָאָנאָטיק קאָראָנאַווירוסעס ימערדזשד פון כייַע מחנות און געפֿירט גרויס-וואָג אַוטברייקס פון שטרענג רעספּעראַטאָרי ינפעקשאַנז אין יומאַנז.אַרייַנגערעכנט פּערסיסטענט פּאַנדעמיקס געפֿירט דורך שטרענג אַקוטע ינפעקטיאָוס חולאתן.רעספּעראַטאָרי סינדראָום קאָראָנאַווירוס 2 (סאַרס-קאָוו -2) (4-7).נידאָווירוס טיילן אַ פּראָסט גענאָמע אָרגאַניזאַציע, און די סובוניט פון די מעמבראַנע-געבונדן רעפּלאַקיישאַן-טראַנסקריפּשאַן קאָמפּלעקס (RTC) איז קאָדעד אין די 5-?²-וואָקזאַל צוויי-טערדז און די הויפּט סטראַקטשעראַל סאַבוניט פון די ווירוס פּאַרטאַקאַל, ווי געזונט ווי עטלעכע אַקסעסעריז. .פּראָטעין, קאָדעד אין די 3??² סוף דריט פון די גענאָמע (1).אַחוץ פֿאַר איין משפּחה פון פּלאַנערי ווירוסעס (Monoviridae) (8), אַלע נעסטעד ווירוסעס ענקאָוד RTC סובוניץ אין צוויי גרויס עפענען לייענען ראָמען (ORF) ORF1a און ORF1b, וואָס זענען איבערגעזעצט פֿון גענאָמיק רנאַ פון.ORF1a קאָדעס פּאָליפּראָטעין (פּפּ) 1אַ, און ORF1a און ORF1b צוזאַמען קאָד פּפּ1אַב.מיט דער אַלגעמיין אָנטייל פון די הויפּט פּראָטעאַסע (Mpro) קאָדעד דורך ORF1a, ביידע pp1a און pp1ab זענען פּראָטעאָליטיקלי פּראַסעסט אין אַ פאַרשיידנקייַט פון ניט-סטראַקטשעראַל פּראָטעינס (נספּס), אויך באקאנט ווי 3CLpro, ווייַל עס האט כאָומאַלאַדזשי מיט די 3Cpro פון די פּיקערנאַווירוס ( 9).די נספּס זענען געמיינט צו זיין פארזאמלט אין אַ גרויס דינאַמיש RTC, קאַטאַליזירן די סינטעז פון גענאָמיק רנאַ (רעפּלאַקיישאַן) און אַ סכום פון סובגענאָמיק רנאַ (טראַנסקריפּשאַן), און זענען געניצט צו קאָואָרדאַנאַט די אויסדרוק פון די ORF לאָוקייטאַד דאַונסטרים פון ORF1b (10? ?12).
די האַרץ RTC כולל רנאַ-אָפענגיק רנאַ פּאָלימעראַסע (רדרפּ) (13), סופּערפאַמילי 1 העליקאַסע (HEL1) (14, 15) און עטלעכע רנאַ פּראַסעסינג ענזימעס, וואָס זענען דער הויפּט קאָדעד אין ORF1b און אין די קאָראָנאַווירוס משפּחה, עס כּולל nsp12-nsp16 און nsp9-nsp12 אין די Arterioviridae משפּחה (זען רעפֿערענץ 10âââ12).RdRp און HEL1 רעפּראַזענץ צוויי (איין פינפט) קאַנסערווד דאָומיינז פון די פויגל ס נעסט ווירוס און האָבן כאָומאַלאַדזשי צווישן אנדערע רנאַ ווירוסעס.קאָר רעפּליקע איז געגלויבט צו זיין אַססיסטעד דורך אנדערע סובוניץ, אַרייַנגערעכנט עטלעכע קליין נספּס רעלעאַסעד פֿון די קאַרבאָקסי-וואָקזאַל (C-וואָקזאַל) געגנט פון פּפּ1אַ, דאַונסטרים פון מפּראָ (קאָראָנאַווירוס נספּ 5 און אַרטעריאַל ווירוס נספּ 4, ריספּעקטיוולי).זיי האָבן לימיטעד משפּחה-ספּעציפיש שוץ און דייווערס אַקטיוויטעטן (ריוויוד אין דערמאָנען 10ââ12).
לעפיערעך לעצטנס, אַ פעלד מיט יינציק סיקוואַנס מאָטיף קעראַקטעריסטיקס איז געפֿונען אין די אַמינאָ טערמינוס (N-טערמינוס) שכייניש צו RdRp אין אַלע נעסטעד ווירוסעס, אָבער קיין אנדערע רנאַ ווירוסעס (16).באַזירט אויף זיין אָרט און נוקלעאָטידע טראַנספעראַסע (נוקלעאָסידע מאָנאָפאָספאַטע [נמפּ] טראַנספעראַסע) טעטיקייט, דעם פעלד איז גערופֿן NiRAN (Nestvirus RdRp-פֿאַרבונדענע נוקלעאָטידע טראַנספעראַסע).די צווייענדיק פעלד קאָמבינאַציע פון NiRAN-RdRp קאַנסטאַטוץ nsp12 אין די Coronaviridae משפּחה און nsp9 אין די Arterioviridae משפּחה, און אין אנדערע נעסטאָווירידאַע, NiRAN-RdRp איז געריכט צו זיין פריי ווי אַ פרייַ נספּ פון די וויראַל פּאָליפּראָטעין.אין די קאָראָנאַווירוס, די NiRAN פעלד כּולל ??1/450 רעזאַדוז און איז פארבונדן צו די C-וואָקזאַל RdRp פעלד דורך די לינקער געגנט (16?19).אין עקווינע אַרטעריטיס ווירוס (עאַוו) (אַרטערווירידאַע), רעקאָמבינאַנט nsp9 ווייזט Mn2+ יאָן-אָפענגיק (זיך) UMPylation און GMPylation אַקטיוויטעטן, וואָס אָפענגען אויף דריי קאַנסערווד סיקוואַנס באַסעס אין נעסטאָווירוס, AN, BN און CN די רעזאַדוז אין די סיקוואַנס.ווו N שטייט פֿאַר NiRAN) (16).די N-וואָקזאַל פלאַנגקינג פון די מאָוטיפס איז אַ ווייניקער קאָנסערוואַטיווע מאָטיף פּרעאַן.עטלעכע פון די רעזאַדוז זענען אויך קאַנסערווד אין ווייַט פֿאַרבונדענע פּראָטעין קינאַסעס, ווו זיי האָבן שוין געוויזן צו זיין ינוואַלווד אין נוקלעאָסידע טריפאָספאַטע (נטפּ) ביינדינג און קאַטאַליטיק טעטיקייט (20, 21).קאָנסיסטענט מיט דעם אָבסערוואַציע, עטלעכע שליסל אַקטיוו פּלאַץ רעזאַדוז אין די פּסעודאָקינאַסע סעלאָ פֿון Pseudomonas syringae קענען זיין פארזאמלט מיט די לעצטנס ארויס SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 סופּערקאָמפּלעקס.קאַנסערווד קאָראָנאַווירוס NiRAN רעזאַדוז סופּעראַמפּאָוזד אין די עלעקטראָן מיקראָסטרוקטורע.רעקאָמבינאַנט פּראָטעין (17).עס איז ספּעקיאַלייטיד אַז די דאַקיומענטאַד (זיך) ו / גמפּילאַטיאָן וועט פּראָדוצירן אַ טראַנזשאַנט שטאַט צו אַריבערפירן נמפּ צו די (דערווייַל אומבאַקאַנט) סאַבסטרייט (16), און די סטראַקטשעראַל ענלעכקייט צווישן NiRAN און פּראָטעין קינאַסע (17, 19) איז די כייפּאַטאַסאַס אַז NiRAN מאַדאַפייז אנדערע פּראָטעינס.
פילע פֿעיִקייטן, אַרייַנגערעכנט זייַן יינציק און יינציק סיסטעמאַטיש פאַרבאַנד מיט נעסטעד ווירוסעס און גענעטיק צעשיידונג פון RdRp, מאַכן NiRAN אַ גלייַך שליסל רעגולאַטאָרי ענזיים פֿאַר נעסטעד ווירוסעס, וואָס איז קריטיש צו זייער ימערדזשאַנס און אידענטיטעט.ביז אַהער, דריי מעגלעך פאַנגקשאַנז ינוואַלווד NiRAN צו רעגולירן גענאָמע / סובגענאָמיק איבערזעצונג אָדער רעפּלאַקיישאַן / טראַנסקריפּציע זענען גערופֿן.ווען קאַנסידערינג די קנאַפּ און דערענדיקט דאַטן בנימצא אין דער צייט, יעדער פונקציע האט זייַן אַדוואַנטידזשיז און דיסאַדוואַנטידזשיז (16).אין דעם פאָרשונג, מיר צילן צו פאַרבינדן די בייאָוקעמיקאַל און פאַרקערט גענעטיק שטודיום פון די קאָראָנאַווירוסעס רעפּריזענטינג די צוויי גענעראַ, און שטעלן אונדזער פיינדינגז אין די עוואָלוטיאָנאַרי הינטערגרונט פון די נאַטירלעך מיוטיישאַן פון די קאָראָנאַווירוס משפּחה, אַזוי צו באַקומען ינסייט אין דעם מיסטעריעז מעלוכע.מיר באַריכט הויפּט אַדוואַנסיז אין די פארשטאנד פון NiRAN דורך די לעגיטימאַציע פון נאַטירלעך טאַרגאַץ אין RTC, וואָס (צווישן די דריי בנימצא כייפּאַטאַסאַז) קאַנטריביוץ צו די ראָלע פון דעם פעלד אין ינישיייטינג די סינטעז פון נעסטעד ווירוס רנאַ.דער פאָרשונג אויך אָפּענס אַפּערטונאַטיז פֿאַר אנדערע ראָלעס פון NiRAN אויף די ווירוס באַלעבאָס צובינד.
כּדי צו קעראַקטערייזירן די ענזימאַטיק פּראָפּערטיעס פון די קאָראָנאַ ווירוס nsp12-פֿאַרבונדענע NiRAN פעלד, מיר געשאפן אַ רעקאָמבינאַנט פאָרעם פון מענטשלעך קאָראָנאַווירוס 229E (HCoV-229E) nsp12 אין E. coli, מיט אַ His6 קוויטל אין די C-טערמינוס, און קאַמביינד די פּראָטעין מיט [α32-P] ינקובאַטע צוזאַמען מיט NTP אין דעם בייַזייַן פון MnCl2 ווי דיסקרייבד אין מאַטעריאַלס און מעטהאָדס.די אַנאַליסיס פון די רעאַקציע פּראָדוקט ינדיקייץ די בייַזייַן פון אַ ראַדיאָלאַבעלעד פּראָטעין קאָ-מיגרייטינג מיט nsp12 (106 kDa), וואָס ינדיקייץ אַז קאָראָנאַווירוס nsp12 קאַטאַלייזיז די פאָרמירונג פון קאָוואַלענט פּראָטעין-נמפּ אַדדוקץ, פּרעפערענטשאַלי געשאפן מיט ורידינע מאָנאָפאָספאַטע (ומפּ) (פיגורע 1 אַ) און ב).קוואַנטיטאַטיווע אַנאַליסיס געוויזן אַז קאַמפּערד מיט אנדערע נוקלעאָטידעס, די סיגנאַל ינטענסיטי פון UMP ינקאָרפּעריישאַן געוואקסן דורך 2 צו 3 מאל (פיגורע 1 ק).די דאַטן זענען קאָנסיסטענט מיט די פּרעדיקטעד NMP טראַנספעראַסע טעטיקייט פון די NiRAN פעלד פון די קאָראָנאַווירוס (16), אָבער ינדיקייץ אַז די נוקלעאָטידע פּרעפֿערענצן פון די NiRAN פעלד פון די קאָראָנאַווירוס און די אַרטעריאַל ווירוס זענען אַנדערש.
זיך-נמפּילאַטיאָן טעטיקייט פון HCoV-229E nsp12.(א) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) איז ינגקיובייטיד מיט די דעזיגנייטיד [α-32P] NTP אין דעם בייַזייַן פון 6 מם MnCl2 פֿאַר 30 מינוט (זען מאַטעריאַלס און מעטהאָדס פֿאַר דעטאַילס).די אָפּרוף פּראָדוקטן זענען אפגעשיידט דורך SDS-PAGE און סטיינד מיט Coomassie בריליאַנט בלוי.(ב) די ראַדיאָלאַבעלעד פּראָטעין איז וויזשוואַלייזד דורך פאַספעראַס ימידזשינג.די שטעלעס פון nsp12-His6 און פּראָטעין מאָלעקולאַר מאַסע מאַרקערס (אין קילאָדאַלטאָנס) זענען געוויזן אין א און בי.*P≤0.05.דער סיגנאַל שטאַרקייט (פּראָצענט) איז שייך צו UTP.
כאָטש NiRAN-פֿאַרבונדענע ענזיים אַקטיוויטעטן האָבן שוין געוויזן צו זיין יקערדיק פֿאַר די רעפּלאַקיישאַן פון EAV און SARS-CoV אין צעל קולטור (16), די ספּעציפיש NiRAN פונקציע און פּאָטענציעל טאַרגאַץ זענען נאָך נישט באשלאסן.די לעצטנס געמאלדן סטראַקטשעראַל ענלעכקייט צווישן NiRAN און אַ משפּחה פון פּראָטעינס מיט פּראָטעינס קינאַסע-ווי פאָולדז (17, 22) פּראַמפּטיד אונדז צו פּרובירן די כייפּאַטאַסאַס אַז NiRAN קאַטאַלייזיז די נמפּילאַטיאָן פון אנדערע פּראָטעינס.מיר דזשענערייטאַד אַ סכום פון פּאָטענציעל כאָומאַלאַדזשיאַס טאַרגאַץ, אַרייַנגערעכנט ניט-סטראַקטשעראַל פּראָטעינס קאָדעד דורך HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), יעדער מיט אַ C-וואָקזאַל His6 קוויטל (SI אַפּפּענדיקס, טאַבלע S1), און ינקובייט די פּראָטעינס מיט [α32-P] ורידינע טריפאָספאַטע ([α32-P]UTP) אין דעם בייַזייַן אָדער אַוועק פון nsp12.באָווין סערום אַלבומין און MBP-LacZα פוסיאָן פּראָטעין געשאפן אין E. קאָלי געדינט ווי קאָנטראָלס (פיגורע 2 אַ, ליינז 1 צו 7).די ראַדיאָלאַבעלעד פּראָטעין איז געווען אַנאַלייזד דורך סאָדיום דאָדעקיל סאַלפייט-פּאָליאַקרילאַמידע געל עלעקטראָפאָרעסיס (SDS-PAGE) און אַוטאָראַדיאָגראַפי, און עס איז געפונען אַז עס איז געווען אַ שטאַרק ראַדיאָאַקטיוו סיגנאַל אין דער אָפּרוף מיט nsp12 און nsp9.די שטעלע פון דער סיגנאַל קאָראַספּאַנדז צו די מאָלעקולאַר מאַסע פון nsp9, ינדאַקייטינג nsp12-מעדיאַטעד ומפּילאַטיאָן פון nsp9 (פיגורע 2ב, שפּור 7).קיין אנדערע פּרובירן פּראָטעינס זענען געפֿונען צו זיין UMPylated, וואָס געפֿירט אונדז צו פאַרענדיקן אַז nsp9 איז אַ ספּעציפיש סאַבסטרייט פון nsp12.קאָנסיסטענט מיט די זיך-נמפּילאַטיאָן דאַטן געוויזן אין פיגור 1, nsp12 איז ביכולת צו אַריבערפירן אַלע פיר נמפּס צו nsp9, כאָטש די עפעקטיווקייַט איז אַנדערש, UMP> אַדענאָסינע מאָנאָפאָספאַטע (אַמפּ)> גואַנאָסינע מאָנאָפאָספאַטע (גמפּ)> סיטידינע מאָנאָפאָספאַטע (קמפּ)) בילד).3 א און ב).אונטער די באדינגונגען געניצט אין דעם אַסעי (פאַרקירצן די אָפּרוף און ויסשטעלן צייט, רעדוצירן די קאַנסאַנטריישאַן פון nsp12; מאַטעריאַלס און מעטהאָדס), די זיך-נמפּילאַטיאָן פון nsp12 קען נישט זיין דיטעקטאַד (פאַרגלייַכן פיגורע 2 ב, שטעג 7 און פיגורע 1 ב), וואָס פּרוווד אַ עפעקטיוו (און קייפל ראָונדס) UMP אריבערגעפארן פון nsp12 צו nsp9.UMP טראַנספעראַסע טעטיקייט ריקווייערז די בייַזייַן פון Mn2+ ייאַנז, ווי געוויזן אין פיגורע 3C, בשעת בלויז מינימאַל UMP טראַנספעראַסע טעטיקייט איז באמערקט אין דעם בייַזייַן פון Mg2+, און קיין טעטיקייט אין דעם בייַזייַן פון די אנדערע צוויי דייוואַלאַנט קיישאַנז טעסטעד.ענלעכע דאַטן זענען באקומען אין נמפּילאַטיאָן אַססעס מיט סיטידינע טריפאָספאַטע (קטפּ), גואַנאָסינע טריפאָספאַטע (גטפּ), און אַדענאָסינע טריפאָספאַטע (אַטפּ) (סי אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 1).
HCoV-229E nsp12-מעדיאַטעד ומפּילאַטיאָן פון nsp9.א סעריע פון פּראָטעין סאַבסטרייץ (אַרייַנגערעכנט באָווין סערום אַלבומין, MBP-lacZα און אַ סעריע פון HCoV-229E nsps מיטן נאָמען C-וואָקזאַל His6 קאָדעד דורך ORF1a) זענען געניצט צו אָפּשאַצן די UMPylation טעטיקייט פון HCoV-229E nsp12-His6⁺-מעדיע. פּראָטעין.ינגקיובייט די פּראָטעין מיט [α-32P] UTP פֿאַר 10 מינוט אין דער אַוועק (א) אָדער בייַזייַן (ב) פון nsp12 ווי דיסקרייבד אין די מאַטעריאַלס און מעטהאָדס.אין די שפּיץ פון א און ב, סדס-פּאָליאַקרילאַמידע געל סטיינד מיט Coomassie Brilliant Blue איז געוויזן, און אין די דנאָ פון א און ב, די קאָראַספּאַנדינג אַוטאָראַדיאָגראַמס זענען געוויזן.די שטעלע פון די פּראָטעין מאָלעקולאַר מאַסע מאַרקער (אין קילאָדאַלטאָנס) איז געגעבן אויף די לינקס.די שטעלע פון nsp12-His6 (ב, שפּיץ) און די ראַדיאָאַקטיוו סיגנאַל באמערקט בעשאַס די ינגקיוביישאַן פון nsp12-His6 מיט nsp9-His6 (ב, שטעג 7) זענען אויך אנגעוויזן, וואָס ינדיקייץ אַז [α-32P]UMP צו nsp9-His6 (12.9 kDa), וואָס איז נישט באמערקט פֿאַר אנדערע פּראָטעינס טעסטעד.
HCoV-229E NiRAN-מעדיאַטעד בייאָוקעמיקאַל און וויראָלאָגיקאַל קעראַקטעריסטיקס פון נספּ9 נמפּילאַטיאָן.(א און ב) די ראָלע פון די נוקלעאָטידע קאָ-סאַסטרייט געניצט אין דער אָפּרוף.Nsp12-His6 און NSP9-His6 זענען געמישט און ינקובייטיד אין דעם בייַזייַן פון פאַרשידענע [α-32P] NTPs אין די נאָרמאַל נמפּילאַטיאָן אַסייַ.(א, שפּיץ) קאָאָמאַסי-סטיינד נספּ9-היס6 אפגעשיידט דורך SDS-PAGE.(א, דנאָ) אַוטאָראַדיאָגראַף פון דער זעלביקער געגנט פון די געל.(ב) די קאָרעוו טעטיקייט (מיטן ± סעם) אין דעם בייַזייַן פון די דעזיגנייטיד נוקלעאָטידע קאָפאַקטאָר איז באשלאסן פון דרייַ פרייַ יקספּעראַמאַנץ.*P≤0.05.(C) די ראָלע פון מעטאַל ייאַנז.דער נאָרמאַל נמפּילאַטיאָן פּראָבע איז געוויזן אין דעם בייַזייַן פון [α-32P] UTP און פאַרשידענע מעטאַל ייאַנז, יעדער מיט אַ קאַנסאַנטריישאַן פון 1 מם.אין C, די שפּיץ, Coomassie סטיינד nsp9-His6 איז געוויזן, און אין C, די דנאָ, די קאָראַספּאַנדינג אַוטאָראַדיאָגראַפי איז געוויזן.די גרייס פון דעם לייבאַלד פּראָטעין (אין קילאָדאַלטאָנס) איז געוויזן צו די לינקס פון A און C. (ד) די מוטאַנט פאָרעם פון HCoV-229E nsp12-His6 וואָס טראגט די ספּעסיפיעד אַמינאָ זויער סאַבסטיטושאַן איז אין [α-32P]UTP, ווי דיסקרייבד אין מאַטעריאַלס און מעטהאָדס.די ראַדיאָלאַבעלעד nsp9-His6 געשאפן אין די NMPylation אָפּרוף איז דיטעקטאַד דורך פאָספאָרילאַטיאָן ימידזשינג (ד, שפּיץ).די קאָרעוו טעטיקייט קאַמפּערד מיט די ווילד-טיפּ (ווט) פּראָטעין איז געוויזן אין ד, און די דנאָ איז גענומען ווי די דורכשניטלעך (± סעם) פון דריי ינדעפּענדענט עקספּערימענט.אַסטעריסקס אָנווייַזן סאַבסטיטושאַנז פון ניט-קאַנסערווד רעזאַדוז.(E) די ווירוס טיטער אין די קולטור סופּערנאַנטאַנט פון פּ 1 סעלז באקומען 24 שעה נאָך ינפעקציע איז באשלאסן דורך פּלאַק אַססייַ.די קאָדאָן סאַבסטיטיושאַנז אין די NiRAN פעלד פון די ענדזשאַנירד HCoV-229E מוטאַנט זענען אנגעוויזן (רעשט נאַמבערינג איז באזירט אויף זייער שטעלע אין pp1ab).די רעפּלאַקיישאַן-דיפישאַנט RdRp אַקטיוו פּלאַץ מוטאַנט nsp12_DD4823/4AA איז געניצט ווי אַ קאָנטראָל.
אין סדר צו באַקומען אַ דיפּער פארשטאנד פון די אַקטיוו פּלאַץ פון NiRAN און באַשטימען די רעזאַדוז שייַכות צו די טעטיקייט פון nsp9-ספּעציפיש NMP טראַנספעראַסע, מיר דורכגעקאָכט מיוטיישאַן אַנאַליסיס, אין וואָס מיר ריפּלייסט די קאָנסערוואַטיווע רעזאַדוז אין די NiRAN AN, BN און CN מאָוטיפס ( 16) עס איז אַלאַ (סי אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 2).אין אַדישאַן, די פּראַל פון קאָנסערוואַטיווע אַרג-צו-ליס אָדער ליס-צו-אַרג סאַבסטיטיושאַנז איז עוואַלואַטעד אין צוויי קאַסעס.ווי אַ (נעגאַטיוו) קאָנטראָל, רעזאַדוז וואָס זענען נישט אָדער ווייניקער קאַנסערווד אין די NiRAN פעלד פון קאָראָנאַווירוסעס און אנדערע נעסטעד ווירוסעס זענען ריפּלייסט מיט Ala. BN) און D4280A (CN) באטייטיק ראַדוסאַז אָדער אפילו ילימאַנייץ נספּ9 נמפּילאַטיאָן דורך נספּ12, בשעת פּראָטעינס מיט קאָנסערוואַטיווע סאַבסטיטושאַנז (R4178K), K4116R) ריטיין 60% און 80% פון זייער טעטיקייט, וואָס ינדיקייץ אַז די אָפּרו פון די ריסטריקשאַנז אויף זייער ריספּעקטיוו זייַט קייטן איז פיזיקאָטשעמיקאַללי שפּירעוודיק (פיגורע 3 ד).ריפּלייסינג עטלעכע אנדערע קאַנסערווד רעזאַדוז E4145A, D4273A, F4281A און D4283A איז פיל ווייניקער שעדלעך, און nsp9 UMPylation איז בלויז מאַדעראַטלי רידוסט.ענלעכע רעזולטאטן זענען באקומען אין nsp9 נמפּילאַטיאָן ריאַקשאַנז ינוואַלווינג אנדערע נטפּס (פיגורע 3 ד און סי אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 3), קאַנפערמינג אַז די באמערקט יפעקץ אויף ספּעציפיש אַמינאָ זויער סאַבסטיטיושאַנז זענען פרייַ פון די טיפּ פון נוקלעאָטידע קאָ-סאַסטרייט געניצט.דערנאָך, מיר טעסטעד די מעגלעך פּראַל פון די nsp12 סאַבסטיטיושאַנז אויף די רעפּלאַקיישאַן פון קאָראָנאַווירוסעס אין צעל קולטור.צו דעם סוף, מיר געוויינט צונעמען דזשאַנעטיקלי ענדזשאַנירד קאַמפּלאַמענטשי דנאַ (קדנאַ) טעמפּלאַטעס קלאָונד אין רעקאָמבינאַנט וואַקסאַניאַ ווירוס (23, 24) צו טראַנסקריבירן 5-7 סעלז.טיטריישאַן פון ינפעקטיאָוס ווירוס נאָכקום געשאפן אין די סעלז געוויזן אַז רובֿ HCoV-229E NiRAN מיוטאַנץ זענען נישט פיזאַבאַל (פיגורע 3E).א גרופּע פון ניט-ווייאַבאַל וויראַל מיוטאַנץ כולל אַלטערנאַטיוועס וואָס האָבן שוין געוויזן צו עלימינירן אָדער באטייטיק רעדוצירן נמפּ טראַנספעראַסע טעטיקייט אין וויטראָ (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), אָבער עס זענען צוויי אנדערע אַלטערנאַטיוועס (K4116R, E4145A) % רעזערווירט?זייער ינ וויטראָ נמפּילאַטיאָן טעטיקייט סאַגדזשעסץ אַז נאָך ריסטריקשאַנז זענען ינוואַלווד.סימילאַרלי, צוויי אנדערע מיוטיישאַנז (R4178K, F4281A) וואָס געפֿירט אַ מעסיק פאַרקלענערן אין NiRAN ס ינ וויטראָ נמפּילאַטיאָן טעטיקייט געשאפן לעבן ווירוסעס, אָבער, די ווירוסעס באטייטיק רידוסט טיטערס דורך רעפּלאַקיישאַן.קאָנסיסטענט מיט די ינ וויטראָ טעטיקייט דאַטן געוויזן אין פיגורע 3 ד, ריפּלייסינג פיר אנדערע רעזאַדוז וואָס זענען נישט קאַנסערווד אין קאָראָנאַווירוס און / אָדער אנדערע נעסטעד ווירוסעס (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) געשאפן ווייאַבאַל ווירוסעס. אַ מאַדעראַטלי רידוסט טיטער קאַמפּערד מיט די ווילד-טיפּ ווירוס (פיגורע 3E).
אין סדר צו לערנען צי NiRAN-מעדיאַטעד NMP טראַנספעראַסע טעטיקייט דעפּענדס אויף די אַקטיוו RdRp פעלד, די צוויי קאַנסערווד אַספּ רעזאַדוז ינוואַלווד אין די קאָואָרדאַניישאַן פון דייוואַלאַנט מעטאַל ייאַנז (11) אין RdRp מאָטיוו C זענען ריפּלייסט דורך Ala. זייַן nsp9 נמפּילאַטיאָן טעטיקייט, וואָס ינדיקייץ אַז nsp12-מעדיאַטעד ינ וויטראָ נספּ9 נמפּילאַטיאָן טעטיקייט טוט נישט דאַרפן פּאָלימעראַסע טעטיקייט (סי אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 4).
נאָך גרינדן די nsp9-ספּעציפיש NMP טראַנספעראַסע טעטיקייט פֿאַר nsp12, מיר געפרוווט צו קעראַקטערייז די NMP-nsp9 אַדדוקט דורך מאַסע ספּעקטראָמעטרי (MS).די גאַנץ פּראָטעין מאַסע ספּעקטרום פון רעקאָמבינאַנט HCoV-229E nsp9 געוויזן אַ שפּיץ ביי 12,045 דאַ (פיגורע 4 אַ).די אַדישאַן פון nsp12 האט נישט טוישן די קוואַליטעט פון nsp9, וואָס ינדיקייץ אַז nsp12 און nsp9 וואָלט נישט פאָרעם אַ סטאַביל קאָמפּלעקס אונטער די באדינגונגען געניצט (דענאַטוראַטיאָן) (פיגורע 4 אַ).אין דעם בייַזייַן פון UTP און GTP, די מאַסע מעזשערמאַנט פון דער אָפּרוף מיט nsp9 און nsp12 ריספּעקטיוולי געוויזן אַז די פּראָטעין מאַסע פון UTP אריבערגעפארן 306 דאַ, און די פּראָטעין מאַסע פון GTP אריבערגעפארן 345 דאַ, ינדאַקייטינג אַז יעדער nsp9 מאַלאַקיול ביינדז אַ UMP אָדער GMP. (בילד 4) C און D).עס איז ספּעקיאַלייטיד אַז די ענערגיע פארלאנגט פֿאַר NiRAN-מעדיאַטעד nsp9 נמפּילאַטיאָן קומט פון NTP כיידראַלאַסאַס און פּיראָפאָספאַטע מעלדונג.כאָטש אַ 10-פאַרלייגן מאָלאַר וידעפדיק פון nsp9 (ציל) ווי nsp12 (ענזיים) איז געניצט אין דעם אָפּרוף, כּמעט גאַנץ נמפּילאַטיאָן פון nsp9 איז באמערקט, וואָס ינדיקייץ אַז די ינטעראַקשאַן צווישן nsp12 און nsp9 איז קורץ-געלעבט, און nsp12 קענען NMPylate מער nsp9 אין וויטראָ מאַלאַקיול.
איין נמפּילאַטיאָן פון nsp9 אין דעם בייַזייַן פון nsp12 און UTP אָדער GTP.געוויזן איז די דיקאַנוואַלוטאַד גאַנץ פּראָטעין מאַסע ספּעקטרום פון HCoV-229E nsp9 (SI אַפּפּענדיקס, טאַבלע ס 1) (AD).(א) נספּ9 אַליין, (ב) נספּ9 + נספּ12-היס6, (C) נספּ9 + נספּ12-היס6 אין דעם בייַזייַן פון וטפּ, (ד) נספּ9 + נספּ12-היס6 אין דעם בייַזייַן פון גטפּ.
צו באַשטימען די nsp9 רעזאַדוז UMPylated דורך nsp12, nsp9-UMP איז געווען קלעאַוועד מיט טריפּסין.די ריזאַלטינג פּעפּטיידז זענען אפגעשיידט דורך נאַנאָ-הויך פאָרשטעלונג פליסיק קראָומאַטאַגראַפי (HPLC) און אַנאַלייזד דורך טאַנדאַם מאַסע ספּעקטראָמעטרי (MS / MS) אָנליין.דאַטן אַנאַליסיס מיט די בייאָניק ווייכווארג פּעקל (פּראָטעין מעטריקס) געוויזן UMPylation פון די N-וואָקזאַל אַמינאָ זויער.דעם איז באשטעטיקט מאַניואַלי.די טאַנדאַם מאַסע ספּעקטרום פון די פּריקערסער פּעפּטייד [UMP] NNEIMPGK (SI אַפּפּענדיקס, פיגורע S5A) אנטפלעקט אַ פראַגמענט ביי 421 עם / ז, וואָס ינדיקייץ אַז UMP ביינדז צו רעזאַדו 1 פון nsp9.
אין די N-terminus פון nsp9, Asn איז קאַנסערווד צווישן די מיטגלידער פון אָרטהאָקאָראָנאַווירינאַע (סי אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 6).כאָטש מיר גלויבן אַז די N-וואָקזאַל ערשטיק אַמינע ניטראָגען איז די מערסט מסתּמא אַקסעפּטאָר פֿאַר UMP, מיר באַשלאָסן צו באַקומען נאָך זאָגן פון NMP ביינדינג אין די N-וואָקזאַל.פֿאַר דעם סיבה, די ניט-נמפּילאַטעד און נמפּילאַטעד N-וואָקזאַל פּעפּטייד nsp9 פּיוראַפייד דורך HPLC איז דערייווד אין דעם בייַזייַן פון אַסאַטאָון און סאָדיום סיאַנאָבאָראָהידרידע.אונטער די באדינגונגען, בלויז פריי ערשטיק אַמינעס קענען זיין מאַדאַפייד מיט פּראָפּיל (25).די N-וואָקזאַל nsp9-דערייווד פּעפּטייד מיט די סיקוואַנס NNEIMPGK כּולל צוויי ערשטיק אַמינעס, איינער אין די N-טערמינוס פון Asn און די אנדערע אין די זייַט קייט פון ליס ביי די C-טערמינוס.דעריבער, פּראָפּיל גרופּעס קענען זיין באַקענענ אין ביידע ענדס.די יקסטראַקטיד יאָן טשראָמאַטאַגראַמז פון ניט-נמפּילאַטעד פּעפּטיידז זענען געוויזן אין די סי אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 5 ב.ווי דערוואַרט, N-וואָקזאַל און C-וואָקזאַל (מאָנאָ) פּראָפּילאַטעד (סי אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 5 ב, אויבערשטער שטעג) און דיפּראָפּילאַטעד פּעפּטיידז (סי אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 5 ב, נידעריקער שטעג) קענען זיין יידענאַפייד.דער מוסטער ענדערונגען מיט די נוצן פון די NMPylated N-וואָקזאַל פּעפּטייד פון nsp9.אין דעם פאַל, בלויז C-וואָקזאַל פּראָפּילייטיד פּעפּטיידז קענען זיין יידענאַפייד, אָבער N-וואָקזאַל פּראָפּילאַטעד פּעפּטיידז און דיפּראָפּילאַטעד פּעפּטיידז זענען נישט יידענאַפייד (סי אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 5 ק), וואָס ינדיקייץ אַז UMP איז טראַנספערד צו די N-וואָקזאַל ערשטיק אַמינע צו פאַרמייַדן דעם. גרופּע פון מאכן ענדערונגען.
דערנאָך, מיר פאַרבייַטן (מיט Ala אָדער Ser) אָדער ויסמעקן די קאַנסערווד רעזאַדוז אין די N-טערמינוס פון nsp9 צו דעפינירן ציל-ספּעציפיש קאַנסטריינץ.באַזירט אויף אונדזער MS דאַטן וואָס ווייַזן אַז NiRAN פארמען אַן nsp9-NMP אַדדוקט מיט די ערשטיק אַמינע פון די N-וואָקזאַל רעזאַדו פון nsp9, מיר כייפּאַטאַסייזד אַז nsp9 נמפּילאַטיאָן ריקווייערז די וויראַל בעל פּראָטעאַסע (Mpro, nsp5) צו באַפרייַען די nsp9 N-וואָקזאַל פון זייַן פּאָליפּראָטעין פּריקערסער.צו פּרובירן דעם כייפּאַטאַסאַס, מיר געשאפן אַ פּריקערסער פּראָטעין nsp7-11 מיט nsp9 אין E. קאָלי און דורכגעקאָכט אַ נאָרמאַל נמפּילאַטיאָן פּראָבע אין דעם בייַזייַן פון [α-32P] UTP (מאַטעריאַל און מעטהאָדס).ווי געוויזן אין פיגורע 5A (שטעג 3), די אַנקוט נספּ7-11 פּריקערסער איז נישט ראַדיאָלאַבעלעד מיט nsp12.אין קאַנטראַסט, אויב nsp7-11 איז קלעאַוועד דורך רעקאָמבינאַנט nsp5 צו באַפרייַען nsp9 (און אנדערע נספּס) פון די פּריקערסער, אַ ראַדיאָלאַבעלעד פּראָטעין וואָס מייגרייט מיט nsp9 איז דיטעקטאַד, וואָס באַשטעטיקן אונדזער מסקנא אַז NiRAN און N- סעלעקטיוו פאָרמירונג פון קאָוואַלענט nsp9-NMP אַדדוקץ. .דער וואָקזאַל ערשטיק אַמינע פון די N-וואָקזאַל אַסן (שטעלע 3825 אין pp1a/pp1ab).דער מסקנא איז אויך געשטיצט דורך יקספּעראַמאַנץ ניצן די nsp9 קאַנסטראַקט, וואָס כּולל איינער אָדער צוויי נאָך רעזאַדוז אין די N-טערמינוס.אין ביידע קאַסעס, NiRAN-מעדיאַטעד UMPylation פון nsp9 איז אַבאַלישט (SI אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 7).דערנאָך, מיר געשאפן אַ פּראָטעין מיט איין אָדער צוויי אַסן רעזאַדוז אויסגעמעקט פֿון די 3825-NNEIMPK-3832 פּעפּטייד סיקוואַנס אין די N-וואָקזאַל פון nsp9.אין ביידע קאַסעס, nsp9 UMPylation איז גאָר אפגעשטעלט (פיגורע 5 ב), פּראַוויידינג נאָך זאָגן אַז די פאַקטיש nsp9 N-terminus אַקץ ווי אַ NMP רעסעפּטאָר.
די פּראָטעאָליטיק פּראַסעסינג פון nsp9 און די ראָלע פון N-וואָקזאַל רעזאַדוז אין nsp12-מעדיאַטעד ומפּילאַטיאָן.(א) nsp9 UMPylation ריקווייערז אַ פריי nsp9 N-וואָקזאַל.Nsp7-11-His6 איז פאַר-ינקיובייטיד ביי 30 ° C אין NMPylation דיטעקשאַן באַפער מיט UTP אין דעם בייַזייַן אָדער אַוועק פון רעקאָמבינאַנט Mpro (nsp5-His6).נאָך 3 שעה, אָנהייב די נמפּילאַטיאָן אַסייַי דורך אַדינג nsp12-His6 ווי דיסקרייבד אין מאַטעריאַלס און מעטהאָדס.דער אָפּרוף מיט nsp5-His6 (שטעג 1) און nsp9-His6 (שטעג 2) איז געניצט ווי אַ קאָנטראָל.נאָך 10 מינוט, דער אָפּרוף איז געווען טערמאַנייטיד און דער אָפּרוף געמיש איז אפגעשיידט דורך SDS-PAGE.דער פּראָטעין איז סטיינד מיט Coomassie Brilliant Blue (א, שפּיץ).די Nsp7-11-His6 פּריקערסער און די פּראַסעסט פּראָדוקט ריזאַלטינג פון Nsp5-His6 מעדיאַטעד קלעאַוואַגע זענען געוויזן אויף די רעכט.ביטע טאָן (צוליב זייער קליין גרייס) אַז nsp7 און nsp11-His6 זענען נישט דיטעקטאַבאַל אין דעם געל, און דער אָפּרוף איז סאַפּלאַמענטאַד מיט nsp5-His6 (ליינז 1 און 4; די שטעלע פון נספּ5-היס6 איז אנגעוויזן דורך אַ האַרט קרייַז) אָדער nsp9-His6 (ליין 2) כּולל אַ קליין סומע פון מבפּ (ינדיקאַטעד דורך עפענען קרייזן) ווי ריזידזשואַל ימפּיוראַטיז ווייַל זיי זענען אויסגעדריקט ווי מבפּ פוסיאָן פּראָטעינס (סי אַפּפּענדיקס, טאַבלע ס 1).(ב) די Nsp9-His6 וואַריאַנט פעלן איין אָדער צוויי N-וואָקזאַל אַסן רעזאַדוז (רעשט נאַמבערינג לויט די שטעלע אין pp1a/pp1ab) און איז פּיוראַפייד און ינקובייטיד מיט nsp12-His6 און [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE סטיינד מיט Coomassie איז געוויזן אין די שפּיץ, B, די קאָראַספּאַנדינג אַוטאָראַדיאָגראַף איז געוויזן אין די דנאָ.די שטעלע פון די מאָלעקולאַר וואָג מאַרקער (אין קילאָדאַלטאָנס) איז געוויזן אויף די לינקס.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-וואָקזאַל קאַנסערווד רעזאַדוז זענען ריפּלייסט מיט Ala אָדער Ser, און די זעלבע סומע פון פּראָטעין איז געניצט אין די nsp12-His6 מעדיאַטעד UMPylation אָפּרוף.די אָפּרוף פּראָדוקטן זענען אפגעשיידט דורך SDS-PAGE און סטיינד מיט Coomassie Brilliant Blue (C, שפּיץ), און ראַדיאָלאַבעלעד nsp9-His6 איז דיטעקטאַד דורך פאָספאָרעסענסע ימאַגינג (C, מיטל).ניצן ווילד-טיפּ (wt) פּראָטעין ווי אַ רעפֿערענץ (באַשטעטיקט צו 100%), די קאָרעוו נמפּילאַטיאָן טעטיקייט (מיטן ± סעם) איז קאַלקיאַלייטיד פון דריי פרייַ יקספּעראַמאַנץ.(ד) ווירוס טיטערס אין די פּ1 צעל קולטור סופּערנאַנטאַנט פון Huh-7 סעלז ינפעקטאַד מיט HCoV-229E ווילד-טיפּ Huh-7 סעלז, און מיוטאַנץ וואָס פירן דעזיגנייטיד אַמינאָ זויער סאַבסטיטיושאַנז אין nsp9 זענען באשלאסן דורך פּלאַק אַסייַ.די רעפּלאַקיישאַן-דיפישאַנט RdRp מאָטיוו C טאָפּל מוטאַנט DD4823/4AA איז געניצט ווי אַ נעגאַטיוו קאָנטראָל.
די N-טערמינוס פון nsp9 (ספּעציעל שטעלעס 1, 2, 3 און 6) איז זייער קאַנסערווד צווישן מיטגלידער פון דער אָרטהאָקאָראָנאַווירינאַע סובפאַמילי (סי אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 6).אין סדר צו לערנען די מעגלעך ראָלע פון די רעזאַדוז אין nsp12-מעדיאַטעד nsp9 נמפּילאַטיאָן, צוויי קאָנסעקוטיווע אַסן רעזאַדוז אין די N-טערמינוס פון nsp9 זענען ריפּלייסט מיט Ala אָדער Ser (אַליין אָדער אין קאָמבינאַציע).קאַמפּערד מיט ווילד-טיפּ nsp9, ריפּלייסינג N3825 מיט Ala אָדער Ser ריזאַלטיד אין מער ווי אַ צוויי-פאַרלייגן רעדוקציע אין nsp12-מעדיאַטעד UMPylation (פיגורע 5C).קאָנסיסטענט מיט אונדזער מסקנא אַז נמפּילאַטיאָן אַקערז ביי די N-וואָקזאַל ערשטיק אַמינע אַנשטאָט פון די זייַט קייט פון די N-וואָקזאַל רעזאַדו, מיר באמערקט באַטייַטיק ריזידזשואַל נמפּילאַטיאָן מיט די פאַרבייַט פון N3825A און N3825S.ינטערעסטינגלי, אויב די רגע אַסן איז ריפּלייסט דורך Ala אָדער Ser, nsp9 UMPylation איז שטארקער רידוסט (מער ווי 10 מאל), בשעת די פאַרבייַט פון Ala אין שטעלעס 3, 4 און 6 האט בלויז אַ מעסיק ווירקונג אויף nsp9 UMPylation (פיגורע 2) ) .5C).ענלעכע רעזולטאַטן זענען באקומען מיט ATP, CTP אָדער GTP (SI אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 8).קאַלעקטיוולי, די דאַטן אָנווייַזן די שליסל ראָלע פון N2826 (שטעלע 2 אין nsp9) אין nsp9 נמפּילאַטיאָן.
אין סדר צו באַקומען נאָך זאָגן פון די פאַנגקשאַנאַל קאָראַליישאַן צווישן די N-טערמינוס פון nsp9 און NMPylation, מיר דורכגעקאָכט אַ קייפל סיקוואַנס אַליינמאַנט (MSA) פון די nsp9 סיקוואַנס פון די קאָראָנאַווירוס משפּחה (וועריינג צווישן 104 און 113 רעזאַדוז) (סי אַפּפּענדיקס, פיגורע) ס 6).אין גאַנץ, אין 47 (באקאנט און פּאָטאַטיוו) מינים פון 5 גענעראַ פון די אָרטהאָקאָראָנאַווירינאַע סובפאַמילי וואָס אָנשטעקן פאַרשידענע מאַמאַלז, פייגל, און רעפּטייל מחנות, בלויז 8 רעזאַדוז אין גאַנץ זענען געפונען צו זיין ינווייראַנמענאַל.די מערסט ברייט ענדערונגען, אַרייַנגערעכנט דילישאַנז און ינסערשאַנז, זענען באמערקט אין די סייקאַלז צווישן די צווייטיק סטרוקטור עלעמענטן פון nsp9, ווי באשלאסן דורך פרייַערדיק סטראַקטשעראַל שטודיום (26 ??28).פינף ינווייראַנמענאַל רעזאַדוז זענען געפֿונען אין די β שנירל און α כיליקס פון די C-וואָקזאַל טייל פון נספּ9.דריי ינווייראַנמענאַל רעזאַדוז קאַנסטאַטוט די NNE מאָטיף פון די N טערמינוס פון nsp9.עס איז אנטפלעקט אַז די רגע אַסן פון דעם מאָטיוו איז די בלויז ינווייראַנמענאַל רעזאַדו, וואָס איז אויך שערד דורך די כייפּאַטעטיקאַל nsp9 פון די ווייַט פֿאַרבונדענע זשאַבע קאָראָנאַווירוס, און רעפּראַזענץ די מיקראָהילאַ לעטאָווירוס 1 מינים אין די סובפאַמילי לעטאָווירינאַע פון אַלפאַלעטאָווירוס.די קאַנסערוויישאַן פון רעזאַדוז אין nsp9 צווייטיק סטרוקטור עלעמענטן קענען זיין ראַשאַנאַלייזד דורך סטראַקטשעראַל קאַנסידעריישאַנז צו האַלטן פאָלדינג אָדער באַוווסט רנאַ ביינדינג פּראָפּערטיעס.אָבער, די ריזאַנינג איז נישט אַפּלייז צו די קאַנסערוויישאַן פון NNE, און איידער דעם לערנען, די נאַטור פון די קאַנסטריינץ וואָס באַגרענעצן די ווערייישאַן פון די טריפּעפּטייד סיקוואַנס איז גאָר אַבסקיורד.
אין סדר צו באַשליסן די וויכטיקייט פון nsp9-NMPylation און NNE קאַנסערוויישאַן אין קאָראָנאַווירוס רעפּלאַקיישאַן, מיר געשאפן HCoV-229E מיוטאַנץ, וואָס פירן איין אָדער טאָפּל סאַבסטיטושאַנז פון nsp9 N-וואָקזאַל רעזאַדוז, וואָס ינדיקייץ אַז nsp9 NMPylation איז שעדלעך אין וויטראָ.איידער מיר אָנהייבן, מיר פּרובירן צו ענטפֿערן די קשיא צי די סאַבסטיטיושאַנז (לעבן די nsp8|9 קלעאַוואַגע פּלאַץ) ווירקן די פּראָטעאָליטיק פּראַסעסינג פון די C-וואָקזאַל pp1a געגנט.א סכום פון nsp7-11 פּאָליפּראָטעין קאַנסטראַקשאַנז מיט קאָראַספּאַנדינג סאַבסטיטושאַנז אין די N-טערמינוס פון nsp9 זענען געשאפן אין E. קאָלי און שנייַדן מיט רעקאָמבינאַנט מפּראָ.די פּראָטעאָליטיק קלעאַוואַגע פון די פיר זייטלעך (אַרייַנגערעכנט די nsp9 פלאַנגקינג פּלאַץ) איז נישט באטייטיק אַפעקטאַד דורך קיין ינטראָודוסט סאַבסטיטושאַנז (סי אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 9), עקסקלודינג סטראַקטשעראַל ענדערונגען אין די פּראָטעינס וואָס אַרייַנמישנ זיך מיט Mpro-mediated nsp8 | 9 קלעאַוואַגע (אָדער אנדערע) וועבזייַטל.
Huh-7 סעלז זענען טראַנספעקטעד מיט גענאָמע-לענג HCoV-229E רנאַ, קאָדירונג Ala אָדער Ser סאַבסטיטיושאַנז אין די קאַנסערווד NNE טריפּעפּטיידז (N3825, N3826 און E3827) אין די nsp9 N טערמינוס, וואָס ווייַזן אַז רובֿ פון די מיוטיישאַנז זענען פאַטאַל.מיר זענען ביכולת צו ראַטעווען דעם ווירוס דורך ריפּלייסינג די סער אָדער אַלאַ פון די N-וואָקזאַל אַסן (N2835A אָדער N2835S), אָבער ניט אַנדערש צו צוריקקריגן דעם ווירוס מיט אנדערע איין און טאָפּל מיוטיישאַנז אין די NNE סיקוואַנס (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (פיגורע 5 ד).
די רעזולטאַטן אָנווייַזן אַז די רעפּלאַקיישאַן פון קאָראָנאַווירוסעס אין געוועב קולטור איז לימיטעד (זעלביקער אָדער ענלעך), לימיטעד די נאַטירלעך מיוטיישאַן פון nsp9 נמפּילאַטיאָן זייטלעך אין דעם גוף און שטיצן די שליסל ראָלע פון דעם ענטפער אין די לעבן ציקל פון קאָראָנאַווירוסעס.
אין די לעצטע גאַנג פון יקספּעראַמאַנץ, מיר געשאפן C-וואָקזאַל His6 מיטן נאָמען סאַרס-קאָוו-2 nsp12 און nsp9, און צוויי מוטאַנט פארמען פון nsp12 אין E. קאָלי.די אַקטיוו פּלאַץ רעזאַדוז אין די NiRAN און RdRp דאָומיינז זענען ריספּעקטיוולי ניצן Ala אַנשטאָט (פיגורע 6A און SI אַפּפּענדיקס, טאַבלע ס 2).K4465 אין SARS-CoV-2 nsp12 קאָראַספּאַנדז צו K4135 אין HCoV-229E (SI אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 2), וואָס פּרוווד צו זיין פארלאנגט פֿאַר NiRAN טעטיקייט און HCoV-229E רעפּלאַקיישאַן (פיגורע 3D און E).דער רעזאַדו אויך קאָראַספּאַנדז צו די אַרטעריאַל ווירוס EAV nsp9 K94 רעזאַדו, וואָס איז געווען פריער געוויזן צו זיין נויטיק פֿאַר NiRAN זיך-ומפּילאַטיאָן / זיך-גמפּילאַטיאָן (16).ווי געוויזן אין פיגור 6B, SARS-CoV-2 nsp12 האט UMP טראַנספעראַסע טעטיקייט ניצן nsp9 ווי אַ סאַבסטרייט, בשעת די nsp12_K4465A אַקטיוו פּלאַץ מוטאַנט איז ינאַקטיוו.די טאָפּל סאַבסטיטושאַן אין די SDD כאַראַקטעריסטיש סיקוואַנס פון RdRp מאָטיף C טוט נישט ווירקן UMP טראַנספעראַסע טעטיקייט (פיגורע 6B), וואָס ינדיקייץ אַז RdRp טעטיקייט האט קיין דירעקט ווירקונג אין nsp9 UMPylation.ענלעכע דאַטן זענען באקומען מיט CTP, GTP און ATP (SI אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 10).אין קיצער, די דאַטן אָנווייַזן אַז NiRAN-מעדיאַטעד nsp9 נמפּילאַטיאָן האט אַ קאָנסערוואַטיווע טעטיקייט אין קאָראָנאַווירוסעס רעפּריזענטינג פאַרשידענע גענעראַ פון די orthocoronavirus סובפאַמילי.
SARS-CoV-2 nsp12-מעדיאַטעד נמפּילאַטיאָן פון nsp9.(א) Coomassie סטיינד SDS-polyacrylamide געל וואָס ווייַזן די רעקאָמבינאַנט פּראָטעין געניצט אין די נמפּילאַטיאָן פּרובירן.ווי אַ קאָנטראָל, אַ מוטאַנט פּראָטעין מיט אַקטיוו פּלאַץ סאַבסטיטושאַן אין די NiRAN פעלד (K4465A) און RdRp פעלד (DD5152/3AA) פון SARS-CoV-2 nsp12 איז געניצט.רעזאַדו נאַמבערינג איז באזירט אויף שטעלע אין pp1ab.(ב) אַוטאָראַדיאָגראַף פון ומפּילאַטיאָן דיטעקשאַן ניצן nsp9-His6 און [α-32P]UTP ווי די סאַבסטרייט פון nsp12-His6 (ווילד טיפּ [wt] און מוטאַנט).די מאָלעקולאַר מאַסע (אין קילאָדאַלטאָנס) פון די לייבאַלד פּראָטעין איז געוויזן אויף די לינקס.
NiRAN דאָומיינז זענען בכלל קאַנסערווד אין Nidovirales (16), וואָס ינדיקייץ אַז זיי קאַטאַליזירן ענזימאַטיק ריאַקשאַנז יקערדיק פֿאַר נידאָווירוס רעפּלאַקיישאַן.אין דעם לערנען, מיר זענען ביכולת צו באַווייַזן אַז די NiRAN פעלד פון די קאָראָנאַווירוס טראַנספערס NMP (דזשענערייטאַד פֿון NTP) צו nsp9, אַ מיסטעריעז רנאַ ביינדינג פּראָטעין ינוואַלווד אין ווירוס רעפּלאַקיישאַן (26 ?? 29), צו באַשטימען עס ווי אַ נאַטירלעך ציל און שוטעף פון קאָראָנאַווירוס RTC.
די NiRAN פעלד שאַרעס דריי סיקוואַנס מאָוטיפס (AN, BN און CN), וואָס אַנטהאַלטן אַ זייער קליין נומער פון רעזאַדוז וואָס זענען קאַנסערווד אין אַלע פאַמיליעס אין די מאָנאָפילעטיק אָבער העכסט דיפערענשיייטאַד Nidovirales סדר (8, 16).לעצטע שטודיום האָבן געוויזן אַז זיי זענען סטראַקטשעראַלי שייַכות צו אַ לאַרגעלי אַנקעראַקטערייזד משפּחה פון פּראָטעין קינאַסע-ווי פּראָטעינס, וואָס זענען ערידזשנאַלי גערופן די סעלאָ משפּחה (17, 19, 22, 30, 31).סעלאָ-פֿאַרבונדענע פּראָטעינס האָבן קינאַסע פאָולדז, אָבער פעלן עטלעכע קאַנסערווד אַקטיוו פּלאַץ רעזאַדוז אין קלאסישע קינאַסעס (22, 32).באַזירט אויף די פאַרקערט אָריענטירונג פון ATP מאַלאַקיולז געבונדן צו די אַקטיוו פּלאַץ און סטייבאַלייזד דורך ספּעציפיש ינטעראַקשאַנז, SelO איז כייפּאַטאַסייזד און דערנאָך באשטעטיקט צו אַריבערפירן AMP (אַנשטאָט פאַספייט) צו די פּראָטעין סאַבסטרייט (22), בשעת אן אנדער באַקטיריאַל סעלאָ-ווי פּראָטעין YdiU האט לעצטנס געוויזן צו קאַטאַליזירן די קאָוואַלענט אַטאַטשמאַנט פון UMP צו טיר און זיין רעזאַדוז פון פאַרשידענע פּראָטעין סאַבסטרייץ (33).
אין סדר צו באַשטעטיקן און יקספּאַנד די פּראָגנאָז פון די פּאָטאַטיוו אַקטיוו פּלאַץ רעזאַדוז פון די קאָראָנאַווירוס NiRAN פעלד, מיר געוויינט בייאָוקעמיקאַל און פאַרקערט דזשאַנעטיקס מעטהאָדס צו דורכפירן מיוטיישאַן אַנאַליסיס אויף די קאָראָנאַווירוס nsp12 (פיגור 3D און E און SI אַפּפּענדיקס, פיגורע S3 און טיש) S1â S4).די דאַטן ווייַזן אַז די פאַרבייַט פון HCoV-229E K4135, R4178 און D4280 מיט Ala ילימאַנייץ אין וויטראָ נמפּ טראַנספעראַסע טעטיקייט און ווירוס רעפּלאַקיישאַן אין צעל קולטור (פיגור 3D און E און SI אַפּפּענדיס, פיגור ס 3), וואָס שטיצן זייער בייַזייַן אין NTP γ-פאָספאַטע. (K4135, R4178) און די קאָואָרדאַניישאַן פון אַקטיוו פּלאַץ מעטאַל ייאַנז (D4280).די E4145A סאַבסטיטושאַן פון די קאַנסערווד גלו אין די קייט פון די פויגל ס נעסט ווירוס פּרעדיקטעד צו סטייבאַלייז די K4135 (17) שטעלע איז געוויזן צו עלימינירן וויראַל רעפּלאַקיישאַן, אָבער סאַפּרייזינגלי, די טעטיקייט איז ריטיינד אין די ינ וויטראָ נמפּילאַטיאָן אַסייַ (פיגורע 3 ד און E און SI אַפּפּענדיקס, פיגורע S3 און טאַבלעס S1-S4).א ענלעך אָבסערוואַציע איז געמאכט ווען די קאָראַספּאַנדינג סאַבסטיטושאַן איז ינטראָודוסט אין די ידיו האָמאָלאָג פון סאַלמאָנעללאַ טיפימוריום (ע130אַ) (33).צוזאַמען, די דאַטן שטיצן די רעגולאַטאָרי פונקציע פון דעם קאַנסערווד רעזאַדו אלא ווי די קאַטאַליטיק פונקציע.
ריפּלייסינג די קאַנסערווד Phe רעזאַדו (F4281A) אין די קייט פון נעסטאָווירוס אין די HCoV-229E NiRAN פעלד (8) ריזאַלטיד אין אַ פאַרקלענערן אין NMPylation טעטיקייט אין וויטראָ און אַ באַטייטיק פאַרקלענערן אין ווירוס רעפּלאַקיישאַן אין צעל קולטור (פיגורע 3D, E און SI) אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 3).די דאַטן זענען קאָנסיסטענט מיט די וויכטיק רעגולאַטאָרי פונקציע פון דעם רעזאַדו, אַזאַ ווי די כאָומאַלאַדזשיאַס DFG מאָטיף Phe רעזאַדו געוויזן פריער.אין קלאסישע פּראָטעין קינאַסעס, עס איז טייל פון די Mg2+ ביינדינג שלייף און העלפּס צו אַסעמבאַל און רעגולירן די רוקנביין???פארלאנגט פֿאַר עפעקטיוו קאַטאַליטיק טעטיקייט (32, 34).ריספּעקטיוולי ריפּלייסינג Ala און Arg פֿאַר K4116 רעזאַדוז (אין די פּרעAN מאָטיף), ריספּעקטיוולי ילימאַנייטאַד וויראַל רעפּלאַקיישאַן און, ווי דערוואַרט, האט פאַרשידענע יפעקץ אויף NMP טראַנספעראַסע טעטיקייט אין וויטראָ, דיפּענדינג אויף די אַמינאָ זויער זייַט קייט ינטראָודוסט (פיגור 3D און E און SI אַפּפּענדיס) , פיגורע ס 3).די פאַנגקשאַנאַל דאַטן זענען קאָנסיסטענט מיט די סטראַקטשעראַל אינפֿאָרמאַציע, וואָס ינדיקייץ אַז די רעזאַדו האט געגרינדעט אַ ינטעראַקשאַן מיט ATP פאָספאַטע (17).אין די NiRAN פעלד פון אנדערע נעסטעד ווירוס משפחות, די שטעלע פון HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 איז פאַרנומען דורך Lys, Arg אָדער His (8), וואָס ינדיקייץ אַז די פאַנגקשאַנאַל ריסטריקשאַן פון דעם ספּעציפיש רעזאַדו איז רילאַקסט.די סאַבסטיטושאַן פון D4188A און D4283A ילימאַנייץ אָדער שטארק ראַדוסאַז ענזיים טעטיקייט און ילימאַנייץ ווירוס רעפּלאַקיישאַן (פיגורע 3).די צוויי רעזאַדוז זענען קאַנסערווד אין רובֿ (אָבער ניט אַלע) נעסטעד ווירוסעס (8), וואָס ינדיקייץ אַ וויכטיק משפּחה-ספּעציפיש אָבער עפשער ניט-קאַטאַליטיק פונקציע.אַלאַ סאַבסטיטיושאַנז פון עטלעכע אנדערע ליס און אַספּ רעזאַדוז (K4113A, D4180A, D4197A און D4273A) וואָס זענען נישט קאַנסערווד אין די Coronaviridae אָדער אנדערע Nestioviridae פאַמיליעס (8) זענען געניצט ווי קאָנטראָלס.ווי דערוואַרט, די סאַבסטיטיושאַנז זענען לאַרגעלי טאָלעראַבלע, מיט אַ קליין פאַרקלענערן אין ענזיים טעטיקייט און וויראַל רעפּלאַקיישאַן אין עטלעכע קאַסעס (פיגורע 3 און SI אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 3).קוילעלדיק, די קאָראָנאַווירוס מיוטאַגענעס דאַטן זענען זייער קאָנסיסטענט מיט די זיך-גמפּ און פאַרקערט דזשאַנעטיקס דאַטן פון EAV NiRAN-RdRp (16), אין וואָס EAV nsp9 (קאָראָנאַווירוס nsp12 ortolog) רעזאַדו ק94 (קאָראַספּאַנדינג צו HCoV-229E K4135) וויכטיק פאַנגקשאַנז), ר124 (קאָראַספּאַנדינג צו ר4178), ד132 (קאָראַספּאַנדינג צו ד4188), ד165 (קאָראַספּאַנדינג צו ד4280), פ166 (קאָראַספּאַנדינג צו פ4281).אין אַדישאַן, די HCoV-229E מיוטאַגענעס דאַטן זענען קאָנסיסטענט מיט און יקספּאַנדיד פֿון די פריער רעפּאָרטעד סאַרס-קאָוו גענעטיק דאַטן (16), פּונקט ווי זייער ענלעך צו די באמערקט פֿאַר די קאָראַספּאַנדינג CN מאָטיף Phe-to-Ala מוטאַנט סאַרס-קאָוו_נספּ12. פענאָטיפּע דיסקרייבד -F219A און HCoV-229E_F4281A (פיגורע 3 ד און E און סי אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 3 און טיש ס 1-ס 4).
קאַמפּערד מיט EAV אָרטהאָלאָגס (16), וואָס האָבן אַ קלאָר ייבערהאַנט פֿאַר UTP און GTP (אין די זיך-NMPylation אָפּרוף), אונדזער לערנען ווייזט אַז די קאָראָנאַווירוס NiRAN פעלד (רעפּריזענטיד דורך HCoV-229E און SARS-CoV-2) קענען זיין יפעקטיוולי. טראַנספערד אַלע פיר נמפּס, כאָטש עס איז אַ קליין ייבערהאַנט פֿאַר UMP (Figures 1 און 3).די לעפיערעך נידעריק ספּעסיפיקאַטי פון די ספּעציפיש NTP קאָ-סאַסטרייט איז קאָנסיסטענט מיט די לעצטנס געמאלדן סאַרס-קאָוו-2 nsp7/8/12/13 סופּערקאָמפּאָסיטע סטרוקטור, אין וואָס ADP-Mg2+ ביינדז צו די אַקטיוו פּלאַץ פון NiRAN, אָבער נישט מיט אַדענינע טייל. פון די פאָרמירונג פון ספּעציפיש ינטעראַקשאַנז (17).אין אונדזער לערנען, דער טיפּ פון נוקלעאָטידע געניצט אין די NMPylation אָפּרוף האט קיין דיפערענטשאַל ווירקונג אויף די טעטיקייט פון די מוטאַנט פּראָטעין (SI אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 3), וואָס ינדיקייץ אַז קיינער פון די רעזאַדוז זענען ענג שייַכות צו די ביינדינג פון אַ ספּעציפיש נוקלעאָבאַסע.די סטראַקטשעראַל יקער און פּאָטענציעל בייאַלאַדזשיקאַל באַטייַט פון די פאַרשידענע NTP קאָ-סאַבסטראַט פּרעפֿערענצן באמערקט אין די NiRAN דאָומיינז פון קאָראָנאַווירוסעס און אַרטעריאַל ווירוסעס נאָך זאָל זיין געלערנט;זיי קען זיין אמת אָדער קען זיין רעכט צו די לימיטיישאַנז פון זייער ריספּעקטיוו שטודיום.דערווייַל, עס קענען ניט זיין רולד אויס אַז די פּאָטענציעל NMPylator טעטיקייט פון די אַרטעריאַל ווירוס NiRAN פעלד (קאַמפּערד צו די פריער קעראַקטערייזד זיך-NMPylation טעטיקייט) האט אַ אַנדערש קאָ-סאַבסטראַט ייבערהאַנט, גענומען אין חשבון אַז די ענלעכקייט צווישן די אַרטעריאַל און די קאָראָנאַווירוס. NiRAN פעלד איז ביי זיין שיעור.סיקוואַנס-באזירט פאַרגלייַכן (16).קאַמפּערד מיט די פּסעודאָקינאַסע סעלאָ, וואָס ניצט Mg2+ ווי אַ קאָפאַקטאָר, די טעטיקייט פון קאָראָנאַווירוס און אַרטעריאַל ווירוס NiRAN איז אָפענגיק אויף Mn2+ (16) (פיגורע 3C און SI אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 1).די Mn2+ אָפענגיקייַט און קלאָר ווי דער טאָג ייבערהאַנט פֿאַר UTP איז אַ ומגעוויינטלעך שטריך פון פּראָטעין NMPylators, און איז בלויז לעצטנס באשטעטיקט אין די YdiU פּראָטעין פון Salmonella typhimurium, וואָס קאַטאַלייזיז די שטרענג Mn2+-אָפענגיק פּראָטעין טשאַפּעראָנע UMPylation צו באַשיצן סעלז פון דרוק ינדאַקשאַן צעל ATP בעקן ( 33).
די לעצטנס דיסקרייבד סטראַקטשעראַל ענלעכקייט צווישן די קאָראָנאַווירוס NiRAN פעלד און סעליאַלער פּראָטעין קינאַסעס (17, 19) גיט נאָך שטיצן פֿאַר NiRAN ס פיייקייט צו קאָוואַלענטלי פֿאַרבינדונג נמפּ צו אנדערע פּראָטעינס וואָס מיר האָבן געמאלדן אין דעם לערנען.מיר פאָוקיסט אונדזער זוכן פֿאַר מעגלעך NiRAN טאַרגאַץ אויף פּראָטעינס קאָדעד דורך HCoV-229E ORF1a, וואָס זענען באַוווסט צו גלייַך אָדער מינאַצאַד אַרוישעלפן RTC ס ORF1b-ענקאָודעד רעפּליקע (12, 35).אונדזער יקספּעראַמאַנץ צושטעלן קאַנקלוסיוו זאָגן פֿאַר די עפעקטיוו און ספּעציפיש נמפּילאַטיאָן פון nsp9 (פיגורע 2).אויב דער ציל פּראָטעין איז געניצט אין אַ מאָלאַר וידעפדיק וואָס איז 8 צו 10 מאל העכער ווי אַז פון די ענזיים (נספּ 12), עס איז באשטעטיקט אַז nsp9 איז גאָר (מאָנאָ) נמפּיזעד (פיגורע 4).מיר געפונען אַז די ינטעראַקשאַן צווישן nsp12 און nsp9 איז קורץ-געלעבט און וועט נישט פאָרעם אַ סטאַביל קאָמפּלעקס מיט nsp9 (אין דער אַוועק פון אנדערע RTC סובוניץ).דער מסקנא איז געשטיצט דורך פּראָטעין ינטעראַקשאַן שטודיום אויף די סאַרס-קאָוו פּראָטעאָמע (35).MS אַנאַליסיס יידענאַפייד די ערשטיק אַמינע פון די N-וואָקזאַל רעזאַדו פון nsp9 ווי די NMPylation פּלאַץ (SI אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 5).די פאָרמירונג פון די פאָספאָראַמידאַטע בונד און די N-וואָקזאַל אַמינאָ גרופּע דיסטינגגווישיז די NiRAN-מעדיאַטעד NMPylation טעטיקייט פון די Pseudomonas syringae SelO-מעדיאַטעד AMPylation אָפּרוף, וואָס קאַטאַלייזיז די פאָרמירונג פון אָ-לינגקט AMP ביי Ser, Thr, אָדער טיר רעזאַדוז פּעפּטייד אַדדוקט ( 22), און S. typhimurium YdiU פארמען אָ-לינגקט (מיט טיר) און N-לינגקט (מיט זיין) פּעפּטייד-ומפּ אַדדוקץ.די לימיטעד אינפֿאָרמאַציע בנימצא אויף די סעלאָ משפּחה פון פּראָטעינס ינדיקייץ אַז מיטגלידער פון דעם גרויס פּראָטעין משפּחה זענען זייער אַנדערש אין די פאָרמירונג פון פּעפּטייד-נמפּ אַדדוקץ.דאָס איז אַ טשיקאַווע אָבסערוואַציע וואָס פארדינט ווייַטער לערנען.
די דאַטן באקומען אין דעם לערנען געפירט אונדז צו כייפּאַטאַסייז אַז די NMPylation פון nsp9 ריקווייערז אַ פריי N-טערמינוס.אין דעם קאָנטעקסט פון וויראַל רעפּלאַקיישאַן, דאָס וועט זיין צוגעשטעלט דורך די פּראָטעאָליטיק קלעאַוואַגע פון די nsp8|nsp9 פּראַסעסינג פּלאַץ אין די רעפּליקע פּאָליפּראָטעין pp1a מעדיאַטעד דורך Mpro און pp1ab.אין רובֿ קאָראָנאַווירוסעס, די חילוק צווישן דעם ספּעציפיש פּלאַץ (VKLQ|NNEI אין HCoV-229E) און אַלע אנדערע קאָראָנאַווירוס Mpro קלעאַוואַגע זייטלעך איז אַסן (אלא ווי אן אנדער קליין רעזאַדו, אַזאַ ווי Ala, Ser Or Gly) פאַרנעמען P1â???אָרט (36).די פּעפּטייד קלעאַוואַגע דאַטן באקומען אין די פרי שטודיום געוויזן אַז די קלעאַוואַגע עפעקטיווקייַט פון די nsp8|nsp9 פּלאַץ איז נידעריקער ווי אַז פון אנדערע זייטלעך, וואָס ינדיקייץ אַז 1) דעם ספּעציפיש פּלאַץ קען האָבן אַ רעגולאַטאָרי ראָלע אין די בייַצייַטיק קאָואָרדאַנייטיד פּראַסעסינג פון די C-וואָקזאַל pp1a געגנט, אָדער 2) אַ די ראָלע פון די ספּעציעל קאַנסערווד nsp9 N-terminus אין ווירוס רעפּלאַקיישאַן (37).אונדזער דאַטן (פיגורע 5A) געוויזן אַז די רעקאָמבינאַנט פאָרעם פון nsp9 מיט די פאַקטיש N-וואָקזאַל סיקוואַנס איז יפעקטיוולי נמפּיזעד דורך nsp12.די N-וואָקזאַל פלאַנגקינג סיקוואַנס איז אַוועקגענומען דורך פאַקטאָר Xa (nsp9-His6; SI אַפּפּענדיקס, טאַבלע S1) אָדער Mpro-מעדיאַטעד קלעאַוואַגע (nsp7-11-His6; פיגורע 5A און SI אַפּפּענדיקס, טיש ס1).ימפּאָרטאַנטלי, די אַנקוט nsp9-מיט פּריקערסער nsp7-11-His6 געוויזן קעגנשטעל צו NMPylation פון nsp12, וואָס איז קאָנסיסטענט מיט אונדזער דאַטן, וואָס ינדיקייץ אַז די nsp9-NMP אַדדוקט איז געשאפן דורך די N-וואָקזאַל ערשטיק אַמינע (SI אַפּפּענדיקס, פיגורע ס 5) .צו באַקומען אַ דיפּער פארשטאנד פון NiRAN סאַבסטרייט ספּעסיפיקאַטי, מיר דעמאָלט פאָוקיסט אויף די שכייניש N-וואָקזאַל רעזאַדוז פון nsp9.אין דער אַוועק פון אנדערע פּראָטעינס, זיי זענען סטראַקטשעראַלי פלעקסאַבאַל, פּרעווענטינג זיי צו זיין דיטעקטאַד אין די אַנלייבאַלד פאָרעם פון nsp9 (26 28, 38), וואָס ינדיקייץ זייער לימיטעד נאַטירלעך ווערייישאַן. פֿונקציע פון די nsp9 N-וואָקזאַל פראַגמענט.אַלאַ סאַבסטיטיושאַנז פון קאַנסערווד רעזאַדוז אין דעם געגנט (פיגורעס 5C און D און SI אַפּפּענדיקס, פיגורע S8) אַנטדעקן אַז N3826 איז יקערדיק פֿאַר NSP9 NMPylation אין וויטראָ, בשעת N3825A און E3827A סאַבסטיטיושאַנז פירן צו אַ פאַרקלענערן אין NMPylation, בשעת M3829A און P3830A סאַבסטיטושאַנז טאָן ניט. .דאָך ווירקן nsp9 NMPylation.כאָטש די סאַבסטיטושאַן פון N-וואָקזאַל אַסן (N3825A, N3825S) האט בלויז אַ מעסיק ווירקונג אויף nsp9 NMPylation און ווירוס רעפּלאַקיישאַן אין צעל קולטור (פיגורע 5C און D), די דילישאַן פון אַ Asn רעזאַדו סיקוואַנס פון די N-וואָקזאַל 3825-NN דיפּעפּטידע פּרוווד צו זיין עס איז טויטלעך צו ווירוסעס, וואָס ינדיקייץ אַז איין אַסן רעזאַדו איז פארלאנגט איידער אן אנדער רעזאַדו אין די N-טערמינוס, פּרעפעראַבלי אַסן, כאָטש עס מיינט אַז סאַבסטיטושאַן פון ענלעך רעזאַדוז קענען זיין טייל טאָלעראַטעד (פיגורע 5 ב, C, און ד).מיר פאַרענדיקן אַז די 3825-NN דיפּעפּטייד, ספּעציעל די קאַנסערווד און יקערדיק N3826 רעזאַדו אין די קאָראָנאַווירוס קייט (SI אַפּפּענדיקס, פיגורע ס6), ינשורז די ריכטיק ביינדינג און אָריענטירונג פון די nsp9 N-terminus אין די אַקטיוו פּלאַץ פון NiRAN.
סאַבסטיטוטינג Ala (E3827A) פֿאַר די קאַנסערווד גלו פון אַלע סובפאַמיליעס ריטיינז nsp9 נמפּילאַטיאָן אין וויטראָ אָבער איז טויטלעך פֿאַר ווירוסעס אין צעל קולטור (פיגורע 5C און ד), וואָס ינדיקייץ די נאָך פונקציע פון דעם רעזאַדו, למשל, אין שליסל ינטעראַקשאַנז (נמפּילאַטעד אָדער אַנמאָדיפיעד) ) nsp9 N-terminus און אנדערע סיבות ינוואַלווד אין ווירוס רעפּלאַקיישאַן.Nsp9 מיוטיישאַנז האָבן נישט אַפעקטאַד די פּראָטעאָליטיק פּראָצעס פון nsp9 אָדער קיין שכייניש נספּס (39) (SI אַפּפּענדיקס, פיגורע S9), וואָס ינדיקייץ אַז די טויטלעך פענאָטיפּעס פון עטלעכע נספּ9 מיוטיישאַנז באמערקט זענען נישט געפֿירט דורך די דיסרעגולאַטיאָן פון די C פּראָטעאָליטיק פּראָצעס-וואָקזאַל פּפּ1אַ געגנט. .
די אויבן דאַטן צושטעלן זאָגן אַז נאָך Mpro-מעדיאַטעד באַהאַנדלונג פון די nsp8|9 קלעאַוואַגע פּלאַץ אין pp1a/pp1ab, די N-טערמינוס פון nsp9 קענען זיין UMPylated (אָדער טייל מאַדאַפייד מיט אן אנדער NMP).אין אַדישאַן, די ויסגעצייכנט קאַנסערוויישאַן פון די N-טערמינוס פון nsp9 (אַרייַנגערעכנט די מעשונעדיק און ינווייראַנמענאַל אַסן רעזאַדוז אין די קאָראָנאַווירוס משפּחה) און די פאַרקערט דזשאַנעטיקס דאַטן באקומען אין דעם לערנען (Figures 3E און 5D) געפירט אונדז צו פאַרענדיקן אַז די דיסקרייבד nsp9 NMPylation. איז בייאַלאַדזשיקאַל שייַכות און יקערדיק פֿאַר קאָראָנאַווירוס רעפּלאַקיישאַן.די פאַנגקשאַנאַל קאַנסאַקווענסאַז פון דעם מאָדיפיקאַטיאָן בלייבן צו זיין געלערנט, למשל, וועגן די פריער דיסקרייבד (ניט-ספּעציפיש) nsp9 (אַנמאָדיפיעד פאָרעם) רנאַ ביינדינג טעטיקייט (2628).N-וואָקזאַל נמפּילאַטיאָן קען אויך ווירקן די ינטעראַקשאַן פון נספּ9 מיט פּראָטעין אָדער רנאַ סאַבסטרייץ אָדער די פאָרמירונג פון פאַרשידענע אַסעמבליז פון פיר-מדרגה.די זענען באמערקט אין סטראַקטשעראַל שטודיום און האָבן שוין באשטעטיקט צו זיין פאַנגקשאַנאַלי שייַכות צו קאָראָנאַווירוס רעפּלאַקיישאַן, כאָטש ספּעציעל אין דער אַוועק פון דעם מאָדיפיקאַטיאָן (26-29, 40).
כאָטש די ציל ספּעסיפיקאַטי פון די קאָראָנאַווירוס NiRAN פעלד נאָך דאַרף זיין קעראַקטערייזד אין מער דעטאַל, אונדזער דאַטן ווייַזן אַז די פּראָטעינס ציל ספּעסיפיקאַטי פון די קאָראָנאַווירוס NiRAN פעלד איז זייער שמאָל.כאָטש די קאַנסערוויישאַן פון שליסל אַקטיוו פּלאַץ רעזאַדוז (8, 16) אין די NiRAN פעלד פון אַלע נידאָווירוס פאַמיליעס שטארק שטיצט די טעטיקייט פון די קאַנסערווד NMPylator די פּראָטעינס, די אידענטיטעט פון די סאַבסטרייט ביינדינג קעשענע רעזאַדוז פון דעם פעלד קאַנסערוויישאַן און קאַנסערוויישאַן בלייבט צו זיין קעראַקטערייזד. , און קען זיין אַנדערש צווישן פאַרשידענע משפחות פון נידאָוויראַלעס צוועקן.סימילאַרלי, די באַטייַטיק טאַרגאַץ פון אנדערע נעסטעד ווירוסעס האָבן נאָך צו זיין באשלאסן.זיי קען זיין ווייַט אָרטהאָלאָגס פון nsp9 אָדער אנדערע פּראָטעינס, ווייַל די סיקוואַנסיז אַרויס די פינף רעפּלאַקאַז דאָומיינז וואָס זענען בכלל קאַנסערווד אין נעסטעד ווירוסעס זענען ווייניקער קאַנסערווד (8), אַרייַנגערעכנט די גענאָמע מענגע צווישן Mpro און NiRAN, צווישן זיי, nsp9 איז ליגן אין די קאראנע וויירוס.
אין אַדישאַן, מיר קענען דערווייַל נישט ויסשליסן די מעגלעכקייט אַז די NiRAN פעלד האט נאָך (אַרייַנגערעכנט סעליאַלער) טאַרגאַץ.אין דעם פאַל, עס איז ווערט דערמאָנען אַז די באַקטיריאַל האָמאָלאָגועס אין דעם ימערדזשינג פּראָטעין NMPylators (NMPylators) (30, 31) ויסקומען צו האָבן "בעל רעגיאַלייטערז"?NMP מאַדזשאַלייץ אַ פאַרשיידנקייַט פון סעליאַלער פּראָטעינס צו רעגולירן אָדער עלימינירן זייער דאַונסטרים אַקטיוויטעטן, און דערמיט פּלייינג אַ ראָלע אין אַ פאַרשיידנקייַט פון בייאַלאַדזשיקאַל פּראַסעסאַז, אַזאַ ווי סעליאַלער דרוק ענטפער און רעדאָקס כאָומאָסטאַסיס (22, 33).
אין דעם לערנען (פיגורעס 2 און 4 און SI אַפּפּענדיקס, פיגיערז S3 און S5), מיר זענען ביכולת צו באַווייַזן אַז nsp12 טראַנספערד די UMP (NMP) טייל צו אַ איין (קאַנסערווד) שטעלע אין nsp9, בשעת אנדערע פּראָטעינס זענען נישט מאַדאַפייד אין די געניצט אונטער די באדינגונגען, געזונט-דיפיינד (אלא ווי פרייַ) סאַבסטרייט ספּעסיפיקאַטי איז געשטיצט.קאָנסיסטענט מיט דעם, קאַמפּערד מיט N-וואָקזאַל nsp9 NMPylation, NSP12 ס אייגענע NMPylation טעטיקייט איז זייער נידעריק, די דיטעקשאַן ריקווייערז אַ לענגערע ויסשטעלן צייט פון אַוטאָראַדיאָגראַפי, און אַ 10-פאַרלייגן פאַרגרעסערן אין nsp12 קאַנסאַנטריישאַן איז געניצט.אין אַדישאַן, אונדזער MS אַנאַליסיס ניט אַנדערש צו צושטעלן זאָגן פֿאַר NMPylation פון nsp12, וואָס סאַגדזשעסץ אַז NiRAN פעלד זיך-NMPylation איז (אין בעסטער) אַ צווייטיק טעטיקייט.אָבער, עס זאָל זיין באמערקט אַז אנדערע שטודיום האָבן צוגעשטעלט פּרילימאַנערי זאָגן אַז די זיך-אַמפּילאַטיאָן סטאַטוס פון באַקטיריאַל נמפּילאַטאָר קען קאָנטראָלירן זייער נמפּילאַטיאָן טעטיקייט אויף אנדערע פּראָטעין סאַבסטרייץ (22, 33).דעריבער, מער פאָרשונג איז דארף צו פאָרשן די מעגלעך פאַנגקשאַנאַל יפעקץ פון זיך-נמפּילאַטיאָן אַקטיוויטעטן רעפּאָרטעד פֿאַר EAV nsp9 (16) און קאָראָנאַווירוס nsp12 (דעם לערנען), אַרייַנגערעכנט די פארגעלייגט טשאַפּעראָנע-ווי ווירקונג אויף די פאָלדינג פון די C-וואָקזאַל RdRp פעלד ( 16) ).
ביז אַהער, עטלעכע כייפּאַטאַסאַז וועגן די מעגלעך דאַונסטרים פאַנגקשאַנז פון די נידאָוויראַל NiRAN פעלד האָבן שוין באַטראַכט, אַרייַנגערעכנט רנאַ ליגאַסע, רנאַ-קאַפּט גואַנילאַטע טראַנספעראַסע און פּראָטעין פּריימינג טעטיקייט (16), אָבער קיינער פון זיי איז קאַמפּאַטאַבאַל מיט די בנימצא דאַונסטרים פאַנגקשאַנז.די אינפֿאָרמאַציע באקומען אין די פאלגענדע שטעלעס איז פּונקט דער זעלביקער צייט אָן מאכן נאָך אַסאַמפּשאַנז.די דאַטן באקומען אין דעם לערנען איז מערסט קאָנסיסטענט מיט (אָבער קענען נישט באַווייַזן) אַז די NiRAN פעלד איז ינוואַלווד אין די ינישייישאַן פון פּראָטעין-ינדוסט רנאַ סינטעז.עס איז געווען פריער געגלויבט אַז די פונקציע פון די NiRAN פעלד אין 5 ??²-רנאַ קאַפּינג אָדער רנאַ ליגיישאַן ריאַקשאַנז איז נישט אַפעקטאַד דורך די און שטיצן פון אנדערע דאַטן.דעריבער, פֿאַר בייַשפּיל, די אַקטיוו פּלאַץ פון NiRAN איז באטראכט צו אַרייַנציען די קאַנסערווד אַספּ ווי אַ גענעראַל באַזע (D252 אין Pseudomonas syringae SelO; D4271 אין HCoV-229E pp1ab; D208 אין SARS-CoV-2 nsp12) (SI אַפּפּענדיקס, פיגור 2) ).ס 2) (17, 22, 33), בשעת די קאַטאַליסיס אין די אַטפּ-אָפענגיק רנאַ ליגאַסע און רנאַ קאַפּינג ענזיים איז דורכגעקאָכט דורך די קאָוואַלענט ענזיים (ליסיל-ען) -נמפּ ינטערמידייט, וואָס ינוואַלווז אַ ניט-טשאַנגעד ליס רעזאַדו ( 41).אין אַדישאַן, די מערקווירדיק סיקוואַנס-באזירט ספּעסיפיקאַטי פון די קאָראָנאַווירוס NiRAN פֿאַר קאַנסערווד פּראָטעין טאַרגאַץ און די רילאַקסט ספּעסיפיקייט פֿאַר NTP קאָ-סאַבסטרייץ (פּרעפערס UTP) קעגן NiRAN-מעדיאַטעד קאַפּינג ענזיים אָדער רנאַ ליגאַסע-ווי פאַנגקשאַנז.
דאָך, אַ פּלאַץ פון עקסטרע אַרבעט איז דארף צו באַשטעטיקן און, אויב פּראָווען, פּראָטים וועגן די מעגלעך ראָלע פון nsp9-UMP (nsp9-NMP) אין פּראָטעין-ינדוסט רנאַ סינטעז, וואָס וועט פאַרבינדן עטלעכע טשיקאַווע אָבער (אַזוי ווייַט) ריפּאָרץ פריער געמאלדן. .אפגעזונדערט ע באמערקונגען .פֿאַר בייַשפּיל, עס איז באשלאסן אַז דער סוף פון די נעגאַטיוו-שנירל רנאַ פון קאָראָנאַווירוס סטאַרץ מיט אַן אָליגאָ (ו) שנירל (42, 43).די אָבסערוואַציע איז קאָנסיסטענט מיט דעם געדאַנק אַז די סינטעז פון נעגאַטיוו-שנירל רנאַ איז ינישיייטיד דורך בינדינג די UMPylated פאָרעם פון nsp9 צו די פּאָלי (א) עק (טריגערז), וואָס קען זיין פּראָמאָטעד דורך זייַן רנאַ ביינדינג די טעטיקייט און / אָדער ינטעראַקשאַן מיט אן אנדער RTC פּראָטעין.דער UMP חלק צוגעשטעלט דורך nsp9 קענען דערנאָך זיין געוויינט ווי אַ "אָנפאַנגער" פֿאַר nsp7/8/nsp12-מעדיאַטעד אָליגאָורידילאַטיאָן, ניצן די 3??²-poly (A) עק אין די גענאָמיק רנאַ אָדער אן אנדער אָליגאָ (א)-מיט סיקוואַנס. סערוועס ווי אַ טעמפּלאַטע, ענלעך צו די מעקאַניזאַם געגרינדעט פֿאַר די פּיקרנאַווירוס וופּג פּראָטעין (44).וואָס אויב די פאָרשלאָג איז "ניט-נאָרמאַטיווע"????די אָנהייב פון די (פּראָטעין-ינדוסט) נעגאַטיוו-שנירל רנאַ סינטעז גיט אַ לינק צו די אַבזערוויישאַנז, וואָס ינדיקייץ אַז די קאָראָנאַווירוס נעגאַטיוו-שנירל רנאַ האט UMP (אַנשטאָט UTP) אין זיין סוף (42), וואָס איז באטראכט צו אָנווייַזן אַז נוקלעיק זויער דיסער קלעאַוועס די סוף פאָספאָרילאַטעד דורך אַן אומבאַקאַנט ורידינע-ספּעציפיש ענדאָנוקלעאַסע.אויב עס איז באשטעטיקט, די כיידראָליטיק טעטיקייט פון נוקלעיק זויער קענען העלפֿן באַפרייַען די אָליגאָמעריק ומפּילאַטעד פאָרעם פון נספּ9 פֿון די 5 ² סוף פון די נייסאַנט נעגאַטיוו שנירל.די מעגלעך ראָלע פון nsp9 אין פּראָטעין פּריימינג איז אויך קאָנסיסטענט מיט פריערדיקן פאַרקערט דזשאַנעטיקס שטודיום, וואָס האָבן געוויזן אַז nsp9 (און nsp8) ינטעראַקט קריטיקאַלי און ספּאַסיפיקלי מיט די קאַנסערווד סיס-אַקטינג רנאַ עלעמענט לעבן די 3 סוף פון די קאָראָנאַווירוס גענאָמע.45).לויט צו דעם באַריכט, די פריערדיקע אַבזערוויישאַנז קענען איצט זיין ריפּיטיד און יקספּאַנדיד דורך ווייַטער פאָרשונג.
אין קיצער, אונדזער דאַטן באשלאסן די ספּעציפיש טעטיקייט פון אַ פּראַפּרייאַטערי נעסטעד ווירוס ענזיים קוויטל לינגקט צו RdRp אין די N-טערמינוס.אין קאָראָנאַווירוס, די ניי דיסקאַווערד NiRAN-מעדיאַטעד UMPylator / NMPylator טעטיקייט איז געניצט צו פאַרלאָזנ זיך Mn2+ און שכייניש אַסן רעזאַדוז און פאַרשאַפן די פאָרמירונג פון (נידעריק ענערגיע) פאָספאָראַמידאַטע קייטן מיט די N-וואָקזאַל ערשטיק אַמינע.דורך Mpro-מעדיאַטעד קלעאַוואַגע בייַ די nsp8|9 קלעאַוואַגע פּלאַץ, די nsp9 ציל קענען זיין געוויינט פֿאַר נמפּילאַטיאָן, ינדאַקייטינג די פאַנגקשאַנאַל קאַפּלינג צווישן די פּראָטעאַסע און די NiRAN פעלד, וואָס יקסטענדז צו RdRp.די קאַנסערוויישאַן פון שליסל רעזאַדוז אין די nsp12 NiRAN אַקטיוו פּלאַץ און די nsp9 ציל, קאַמביינד מיט דאַטן באקומען פון צוויי קאָראָנאַווירוסעס אַרייַנגערעכנט סאַרס-קאָוו -2, גיט שטאַרק זאָגן אַז nsp9 נמפּילאַטיאָן איז אַ קאָראָנאַווירוס קאָנסערוואַטיווע פֿעיִקייטן זענען אויך אַ שליסל שריט אין ווירוס רעפּלאַקיישאַן.די בנימצא דאַטן פירן אונדז צו פאַרענדיקן אַז די ספּעציפיש ראָלע פון NMPylated פאָרעם פון nsp9 אין פּראָטעין-ינדוסט רנאַ סינטעז איז אַ גלייַך סצענאַר פֿאַר קאָראָנאַווירוס און אנדערע נעסטעד ווירוסעס, און NiRAN קען אויך ציל אנדערע אַניידענטאַפייד פּראָטעינס.רעגולירן דעם ווירוס.באַלעבאָס ינטעראַקשאַן.אויב באשטעטיקט, די ינוואַלוומאַנט פון פּראָטעין פּרימערז אין וויראַל רנאַ סינטעז וועט פאַרגרעסערן די סיקוואַנס קירבות פון די Mpro/3CLpro און RdRp דאָומיינז צווישן די ביז אַהער דיטעקטאַד קאָראָנאַווירוס און פּיקערנאַווירוס-ווי סופּערגרופּע (9), וואָס זענען איצט יונאַפייד אין די לעצטנס געגרינדעט Pisonivirites (9). 46) אין דער קאַטעגאָריע.
אונדזער דאַטן אויך ווייַזן אַז די יקערדיק, סעלעקטיוו און קאָנסערוואַטיווע ענזיים אַקטיוויטעטן יידענאַפייד אין דעם לערנען קענען זיין געוויינט ווי טאַרגאַץ פֿאַר אַנטיוויראַל דרוגס.קאַמפּאַונדז וואָס אַרייַנמישנ זיך מיט די ביינדינג (און סאַבסאַקוואַנט מאָדיפיקאַטיאָן) פון די קאַנסערווד nsp9 N-terminus אין די אַקטיוו פּלאַץ פון NiRAN קענען זיין דעוועלאָפּעד אין עפעקטיוו און ווערסאַטאַל אַנטיוויראַל דרוגס, פּאַסיק פֿאַר די באַהאַנדלונג פון כייַע און מענטש קאָראָנאַווירוסעס פון פאַרשידענע (סאַב) מין ינפעקטיאָנס , אַרייַנגערעכנט סאַרס-קאָוו -2 און מיטל מזרח רעספּעראַטאָרי סינדראָום קאָראָנאַווירוס.
די קאָדירונג סיקוואַנס פון די קאָראָנאַווירוס פּראָטעין געשאפן אין דעם לערנען איז אַמפּלאַפייד דורך RT-PCR ניצן רנאַ אפגעזונדערט פֿון Huh-7 ינפעקטאַד מיט HCoV-229E אָדער Vero E6 ינפעקטאַד מיט סאַרס-קאָוו-2, און ינסערטאַד מיט נאָרמאַל קלאָונינג פּראָוסידזשערז.pMAL-c2 (ניו ענגלאַנד ביאָלאָגיקאַל לאַבאָראַטאָריע) אָדער pASK3-Ub-CHIs6 (47) אויסדרוק וועקטאָר (סי אַפּפּענדיקס, טאַבלעס ס 1 און ס 2).איין קאָדאָן סאַבסטיטושאַנז זענען ינטראָודוסט דורך פּקר-באזירט פּלאַץ-דירעקטעד מיוטאַגענעס (48).צו פּראָדוצירן די MBP פוסיאָן פּראָטעין, E. coli טב1 סעלז זענען פארוואנדלען מיט די צונעמען pMAL-c2 פּלאַזמיד בויען (סי אַפּפּענדיקס, טאַבלע ס 1).די פוסיאָן פּראָטעין איז פּיוראַפייד דורך אַמילאָסע אַפיניטי קראָומאַטאַגראַפי און קלעאַוועד מיט פאַקטאָר Xa.דערנאָך, די C-וואָקזאַל His6-טאַגד פּראָטעין איז פּיוראַפייד דורך ני-ימאָובאַלייזד מעטאַל אַפיניטי קראָומאַטאַגראַפי (Ni-IMAC) ווי פריער דיסקרייבד (49).צו פּראָדוצירן די וביקוויטין פוסיאָן פּראָטעין, E. coli TB1 סעלז געניצט די צונעמען pASK3-Ub-CHIs6 פּלאַזמיד בויען (SI אַפּפּענדיקס, טאַבלעס S1 און S2) און pCGI פּלאַזמיד דנאַ קאָדירונג וביקוויטין-ספּעציפיש C-וואָקזאַל הידראָלאַסע 1 (ובפּ1).טראַנספאָרמאַציע (47).די C-וואָקזאַל His6-טאַגד קאָראָנאַווירוס פּראָטעין איז פּיוראַפייד ווי פריער דיסקרייבד (50).
די זיך-נמפּילאַטיאָן פּראָבע פון HCoV-229E nsp12-His6 איז דורכגעקאָכט ווי דיסקרייבד אין EAV nsp9 (16).אין קורץ, nsp12-His6 (0.5 μM) כּולל 50 מם 4-(2-הידראָקסיעטהיל) -1-פּיפּעראַזינעעטהאַנעסולפאָניק זויער (HEPES) -KOH, pH 8.0, 5 מם דיטהיאָטהרעיטאָל (דטט), 6 מם מנקל 2, 25 μם באַפער, 25 μם באַפער. די ספּעסיפיעד NTP און 0.17 μM מאַטשט [α32-P] NTP (3,000 סי / ממאָל; Hartmann Analytic) ביי 30 ° C פֿאַר 30 מינוט.אין אַלע אנדערע (נאָרמאַל) נמפּילאַטיאָן אַסאַסאַז פון nsp12-מעדיאַטעד nsp9 נמפּילאַטיאָן, די אָפּרוף טנאָים זענען אַדזשאַסטיד ווי גייט: nsp12-His6 (0.05 μM) און nsp9-His6 (4 μM) אין דעם בייַזייַן פון 50 מם HEPES-KOH (pH 8. ), 5 מם דטט, 1 מם מנקל2, 25 μM ינדיקייץ NTP, און 0.17 μM מאַטשט [α32-P] NTP.נאָך ינגקיובייטינג פֿאַר 10 מינוט ביי 30 ° C, דער אָפּרוף מוסטער איז געמישט מיט SDS-PAGE מוסטער באַפער: 62.5 מם טריס (הידראָקסימעטהיל) אַמינאָמעטהאַנע הקל (pH 6.8), 100 מם דטט, 2.5% סדס, 10% גליסעראָל און 0.005% בראָמאָפענאָל בלוי.דער פּראָטעין איז געווען דענאַטורעד דורך באַהיצונג ביי 90 ° C פֿאַר 5 מינוט און אפגעשיידט דורך 12% SDS-PAGE.די געל איז פאַרפעסטיקט און סטיינד מיט Coomassie Brilliant Blue לייזונג (40% מעטאַנאָל, 10% אַסעטיק זויער, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), דעקאָלאָריזעד און יקספּאָוזד צו אַ פאַספעראַס ימאַגינג פאַרשטעלן פֿאַר 20 שעה (צו דעטעקט נספּ12 פֿון נמפּילאַטיאָן) אָדער (מאַקסימום) 2 שעה (צו אַססעסס nsp9 נמפּילאַטיאָן).א Typhoon 9200 ימאַדזשער (GE העאַלטהקאַרע) איז געניצט צו יבערקוקן די פאַרשטעלן און ImageJ איז געניצט צו אַנאַלייז די סיגנאַל ינטענסיטי.
פֿאַר MS אַנאַליסיס, 1 μM nsp12-His6 און 10 μM nsp9 (אָן העקסאַהיסטידינע קוויטל) זענען געניצט אין נמפּילאַטיאָן אַנאַליסיס (סי אַפּפּענדיקס, טאַבלע ס 1) און די געוואקסן קאַנסאַנטריישאַן פון 500 μM UTP און GTP זענען געניצט.דעפּענדינג אויף זייער קאַנסאַנטריישאַן און דערוואַרט פּראָטעין קוואַליטעט, אַ Waters ACQUITY H-Class HPLC סיסטעם יקוויפּט מיט אַ MassPrep זייַל (Waters) איז געניצט צו דעסאַלט 1 צו 10 μL פון באַפערד פּראָטעין סאַלושאַנז אָנליין.די דעסאַלטעד פּראָטעין איז ילוטאַד אין די ילעקטראָוספּריי יאָן מקור פון Synapt G2Si מאַסע ספּעקטראָמעטער (וואַטערז) דורך די פאלגענדע גראַדיענט פון באַפער א (וואַסער / 0.05% פאָרמיק זויער) און באַפער ב (אַסעטאָניטרילע / 0.045% פאָרמיק זויער), און די זייַל טעמפּעראַטור איז 60 ℃ און אַ לויפן קורס פון 0.1 מל / מין: יסאָקראַטיקלי מיט 5% א פֿאַר 2 מינוט, דעמאָלט אַ לינעאַר גראַדיענט צו 95% ב ין 8 מינוט, און האַלטן 95% ב פֿאַר נאָך 4 מינוט.
Positive ייאַנז מיט אַ מאַסע קייט פון 500 צו 5000 מ / ז זענען דיטעקטאַד.גלו-פיברינאָפּעפּטידע ב איז געמאסטן יעדער 45 סעקונדעס פֿאַר אָטאַמאַטיק מאַסע דריפט קערעקשאַן.ניצן MassLynx קיילע ווייכווארג מיט MaxEnt1 פאַרלענגערונג צו דיקאַנוואַלוו די דורכשניטלעך ספּעקטרום נאָך דידאַקטינג די באַסעלינע און סמודינג.
UMPylated HCoV-229E nsp9 איז געווען דיידזשעסטיד דורך אַדינג סיקוואַנסינג-מיינונג מאַדאַפייד טריפּסין (סערוואַ) און ינקובייטיד יבערנאַכטיק ביי 37 °C.א Chromabond C18WP ספּין זייַל (טייל נומער 730522; Macherey-Nagel) איז געניצט צו דעסאַלט און קאַנסאַנטרייט די פּעפּטיידז.צום סוף, די פּעפּטייד איז צעלאָזן אין 25 μל וואַסער, וואָס כּולל 5% אַסעטאָניטרילע און 0.1% פאָרמיק זויער.
די סאַמפּאַלז זענען אַנאַלייזד דורך מיז ניצן אַן אָרביטראַפּ וועלאָס פּראָ מאַסע ספּעקטראָמעטער (טהערמאָ ססיענטיפיק).די לעצט נאַנאָâ HPLC סיסטעם (דיאָנעקס), יקוויפּט מיט אַ מנהג סוף-מאָונטעד 50 סענטימעטער ??75 μm C18 RP זייַל פּאַקט מיט 2.4 μם מאַגנעטיק קרעלן (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) פאַרבינדן צו די מאַסע ספּעקטראָומער אָנליין דורך די פּראָקסעאָן נאַנאָספּרייַ מקור;אַרייַנשפּריצן 6 μל טריפּסין דיידזשעסטשאַן לייזונג אין אַ 300 μם ינער דיאַמעטער × ??1 סענטימעטער C18 PepMap פאַר-קאַנסאַנטריישאַן זייַל (טהערמאָ ססיענטיפיק).ניצן וואַסער / 0.05% פאָרמיק זויער ווי די סאַלוואַנט, די מוסטער איז אויטאָמאַטיש טראַפּט און דיסאַלינייטיד מיט אַ לויפן קורס פון 6 μל / מין.
די פאלגענדע גראַדיענץ פון וואַסער / 0.05% פאָרמיק זויער (סאַלוואַנט א) און 80% אַסעטאָניטרילע / 0.045% פאָרמיק זויער (סאַלוואַנט ב) זענען געניצט צו דערגרייכן די צעשיידונג פון טריפּטיק פּעפּטיידז מיט אַ לויפן קורס פון 300 נל / מין: 4% ב פֿאַר 5 מינוט, דעמאָלט 30 א לינעאַר גראַדיענט צו 45% ב ין מינוט, און אַ לינעאַר פאַרגרעסערן צו 95% סאַלוואַנט ב ין 5 מינוט.פאַרבינדן די קראָומאַטאַגראַפיק זייַל צו אַ ומבאַפלעקט שטאָל נאַנאָ-עמיטטער (פּראָקסעאָן), און שפּריצן די עלוענט גלייַך צו די העאַטעד קאַפּאַלערי פון די מאַסע ספּעקטראָמעטער ניצן אַ פּאָטענציעל פון 2,300 וו. די יבערבליק יבערקוקן מיט אַ האַכלאָטע פון 60,000 אין די אָרביטראַפּ מאַסע אַנאַליסיס איז פארבונדן מיט בייַ מינדסטער דריי דאַטן MS / MS סקאַנז, דינאַמיקאַללי יקסקלודיד פֿאַר 30 סעקונדעס, ניצן לינעאַר יאָן טראַפּ צונויפשטויס ינדוסט דיססאָסיאַטיאָן אָדער העכער ענערגיע צונויפשטויס דיססאָסיאַטיאָן קאַמביינד מיט אָרביטראַפּ דיטעקשאַן, די האַכלאָטע איז 7,500.
פּאָסטן צייט: Aug-03-2021